新規質量イメージングを用いたＮーアセチルグルコサミン修飾タンパク質の時空間的解析
Publicly Offered Research
| Project Area | Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation |
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| Project/Area Number |
25117710
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
山本 一夫 東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (20174782)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2014)
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| Budget Amount *help |
¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000)
Fiscal Year 2014: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2013: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
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| Keywords | 糖鎖修飾 / 翻訳後修飾 / N-アセチルグルコサミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度は、N-アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするcDNAをHEK293細胞の細胞質や核内に発現させて、核内及び細胞質タンパク質に見出されるN-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)修飾を伸長させることを行い、また、この伸長させた糖鎖に特異的に結合する新規のレクチンを見出した。これらの系を用いて、細胞質及び核内の新規のO-GlcNAc修飾タンパク質を特定したが、これらの糖鎖修飾が、どのアミノ酸残基に伸長した糖鎖が付加されているかについて詳細に検討した。修飾残基が1箇所知られているc-Relタンパク質をモデルとして、Mycタグを付加したc-Rel cDNAを上記のHEK293細胞に発現させ、免疫沈降してウエスタンブロッティングを行うと、GalNAc-GlcNAcに特異的なWJAへの結合が上昇し、抗O-GlcNAc抗体への結合は低下した。また、2次元電気泳動後、c-Relのスポットをゲルから切り出し、トリプシンによるゲル内消化を行い、回収したペプチドをMALDI-TOF質量分析で解析したところ、既知のSer残基が確かに2糖に伸長していることが示された。また、WJAレクチンを用いたアフィニティクロマトグラフィーで糖修飾ペプチドを特異的に精製することを試みたところ、GlcNAc修飾のみのペプチドに比べて2糖の方がレクチンに対する親和性が大きく亢進するため、効率よい濃縮が可能であると思われた。O-GlcNAc修飾のイメージングに関しては、WGAレクチンをGFP融合タンパク質として細胞質内に発現させることを行った。細胞活性化時における変化は、自家蛍光を排除するための対照とするレクチンが必要であり、今後の検討課題である。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(2 results)
Research Products
(10 results)
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[Journal Article] Comprehensive list of lectins: origins, natures, and carbohydrate specificities2014
Author(s)
Kobayashi, Y, Tateno, H, Ogawa, H, Yamamoto, K, Hirabayashi, J.
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Journal Title
Methods Mol. Biol.
Volume: 1200
Pages: 555-577
DOI
ISBN
9781493912919, 9781493912926
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