トップダウンリン酸化プロテオミクスを指向したアフィニティー磁気ビーズの創出

• Project Area: Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation
• Project/Area Number: 25117718
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 木下 英司 広島大学, 医薬保健学研究院(薬), 准教授 (80304418)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥10,660,000 (Direct Cost: ¥8,200,000、Indirect Cost: ¥2,460,000); Fiscal Year 2014: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2013: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
• Keywords: フォスタグ / リン酸化 / プロテオーム / 翻訳後修飾 / マグネットビーズ

Outline of Annual Research Achievements

これまでに申請者は，リン酸基を特異的に捕捉する亜鉛錯体（フォスタグ）をクロマト単体であるアガロースビーズに固定化させた分離剤を開発している。しかしながらこの分離剤は，迅速性と簡便性の点で課題を残していた。本研究では，迅速性や簡便性において特に優れたマグネット技術とフォスタグ技術を融合させることで従来の課題を解決する。当該年度では，前年度に合成した新規リン酸親和性磁気ビーズを利用することにより，分析ターゲットの絞り込みがなされ，リン酸化プロテオーム解析がいっそう容易，かつ，迅速になることを想定しながら以下の検討項目を実施した。
１）リン酸化プロテオーム解析を行うための緩衝液系の決定：リン酸親和性磁気ビーズに亜鉛を十分に結合させる平衡緩衝液として，0.1 M 酢酸亜鉛を含む 0.1 M Bis-Tris-AcOH (pH 7）を使用した。サンプルを結合させ，洗浄する緩衝液として，0.1 M 酢酸ナトリウムを含む 0.1 M Bis-Tris-AcOH (pH 7）を使用した。サンプルを溶出させる緩衝液として，0.1 M ピロリン酸ナトリウム-AcOH（pH 7）を使用した。
２）リン酸化プロテオーム解析の実行：OVISE 細胞のショットガンペプチドを上記の緩衝液系を利用して精製，濃縮を行った。精製濃縮されたペプチド 3.75 μg を質量分析により測定した結果，同定ペプチド数（850以上），並びに同定リン酸化率（90%以上）ともに従来のフォスタグアガローズビーズ法と比較してほぼ同様であることがわかった。さらには，その作業工程に関して，従来法よりも最大で60分以上短縮できることが明らかとなった。
以上のことより，新規リン酸親和性磁気ビーズを用いた本手法が，従来法より迅速性や簡便性において優れていることが証明でき，リン酸化プロテオーム解析にも十分に応用できることが示唆された。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] The cutting edge of affinity electrophoresis technology (2015)
  • Author(s): Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • Journal Title: Proteomes Volume: 3 Issue: 1 Pages: 42-55
  • DOI: 10.3390/proteomes3010042
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Neutral phosphate affinity SDS-PAGE system for profiling of protein phosphorylation (2015)
  • Author(s): Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • Journal Title: Methods Mol. Biol. Volume: 1295 Pages: 323-354
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-2550-6_24
  • ISBN: 9781493925490, 9781493925506
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Profiling of Protein Thiophosphorylation Using Phos-tag Affinity Electrophoresis: Evaluation of Adenosine 5′-O-(3-thiotriphosphate) as a Phosphoryl Donor in Protein Kinase Reactions (2014)
  • Author(s): E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, A. Shiba, K. Edahiro, Y. Inoue, K. Yamamoto, and T. Koike
  • Journal Title: Proteomics Volume: 14 Issue: 6 Pages: 668-679
  • DOI: 10.1002/pmic.201300533
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Simple enrichment of thiol- containing biomolecules by using zinc(II)-cyclen-functionalized magnetic beads (2014)
  • Author(s): Fujioka, H., Tsunehiro, M., Kawaguchi, M., Kuramoto, Y., Kurosaki, H., Hieda, Y., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • Journal Title: J. Sep. Sci. Volume: 37 Issue: 13 Pages: 1601-1609
  • DOI: 10.1002/jssc.201400135
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Identification of cAMP-dependent phosphorylated proteins involved in the formation of environment-resistant resting cysts by the terrestrial ciliate Colpoda cucullus (2014)
  • Author(s): Sogame, Y., Kojima, K., Takeshita, T., Eiji Kinoshita, and Matsuoka, T.
  • Journal Title: Invert. Surviv. J. Volume: 11 Pages: 213-218
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A Phos-tag-based fluorescence quenching system for activity assay and inhibitor screening for alkaline phosphatase (2014)
  • Author(s): Kinoshita-Kikuta, E., Kurosaki, H., Kunisada, N., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • Journal Title: Am. J. Anal. Chem. Volume: 5 Issue: 12 Pages: 796-804
  • DOI: 10.4236/ajac.2014.512088
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Tips on improving the efficiency of electrotransfer of target proteins from Phos-tag SDS-PAGE gel (2014)
  • Author(s): Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, Matsuda, A., and Koike, T.
  • Journal Title: Proteomics Volume: 14 Issue: 21-22 Pages: 2437-2442
  • DOI: 10.1002/pmic.201400380
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Identification of two phosphorylated species of β-catenin involved in the ubiquitin-proteasome pathway by using two-dimensional Phos-tag affinity electrophoresis (2014)
  • Author(s): Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • Journal Title: J. Electrophoresis Volume: 58 Pages: 1-4
  • NAID: 130004713130
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Advances in Phos-tag-based methodologies for separation and detection of the phosphoproteome (2014)
  • Author(s): Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta. Volume: 1854 Pages: 601-608
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] アフィニティー電気泳動技術の最前線 (2014)
  • Author(s): 木下英司，木下恵美子，小池 透
  • Journal Title: ぶんせき Volume: 7 Pages: 365-371
  • NAID: 40020143674
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Phos-tag 電気泳動 (2014)
  • Author(s): 木下英司
  • Journal Title: 電気泳動 -生物物理化学- Volume: 58 Pages: 21-23
  • NAID: 130004704676
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Identification of differentially expressed water-insoluble proteins in the encystment process of Colpoda cucullus by two-dimensional electrophoresis and LC-MS/MS analysis. (2014)
  • Author(s): Sopme, Y., Kojima, K., Takeshita, T., Kinoshita, E., Matsuoka, T.
  • Journal Title: J. Eukaryot. Microbiol. Volume: 61 Issue: 1 Pages: 51-60
  • DOI: 10.1111/jeu.12086
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Phos-tag-based magnetic-bead method for rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules (2013)
  • Author(s): M. Tsunehiro, Y. Meki, K. Matsuoka, E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita and T. Koike
  • Journal Title: Journal of Chromatography B Volume: 925 Pages: 86-94
  • DOI: 10.1016/j.jchromb.2013.02.039
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sandwich assay for phosphorylation of protein multiplexes by using antibodies and Phos-tag (2013)
  • Author(s): E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike
  • Journal Title: Analytical Biochemistry Volume: 438 Issue: 2 Pages: 104-106
  • DOI: 10.1016/j.ab.2013.03.029
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Excystment-dependent alteration of protein expression in terrestrial ciliate Colpoda cucullus. (2013)
  • Author(s): Sogame, Y., Kojima, K., Takeshita, T., Eiji Kinoshita, Funadani, R., and Matsuoka, T.
  • Journal Title: Microbes Environ. Volume: 28 Pages: 388-390
  • NAID: 10031191423
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Increase in Lipophilicity of Enalaprilat by Complexation with Copper(II) or Zinc(II) Ions. (2013)
  • Author(s): Fujioka, H., Hieda, Y., Kuramoto, Y, Konishi, K., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike T.
  • Journal Title: Yakugaku Zasshi Volume: 33 Pages: 1135-1141
  • NAID: 130003361996
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] タンパク質リン酸化修飾の高感度検出法と新しいオミクス技術としての展開． (2013)
  • Author(s): 木下英司，木下恵美子，小池透
  • Journal Title: 生化学 Volume: 85 Pages: 447-552
  • NAID: 10031184265
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phos-tag-Based Microarray Techniques Advance Phosphoproteomics (2013)
  • Author(s): Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta and Tohru Koike
  • Journal Title: Journal of Proteomics & Bioinformatics Volume: S6 Issue: S6 Pages: 8-8
  • DOI: 10.4172/jpb.s6-008
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Phos-tag SDS-PAGE ゲルからの標的タンパク質の転写効率を改善させる秘訣 (2014)
  • Author(s): 木下英司，木下恵美子，小池透
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜市
  • Year and Date: 2014-11-25
• [Presentation] 銅および亜鉛キレート形成によるACE阻害剤エナラプリラトの脂溶性増加 (2014)
  • Author(s): 小西華那世，木下恵美子，木下英司，小池透
  • Organizer: 第65回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 横浜市
  • Year and Date: 2014-10-25
• [Presentation] SuperSep Phos-tag を用いた低分子量リン酸化タンパク質の解析 (2014)
  • Author(s): 脇本理恵子，木下恵美子，木下英司，小池透
  • Organizer: 第65回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 横浜市
  • Year and Date: 2014-10-25
• [Presentation] Phos-tag 電気泳動 (2014)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第65回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 横浜市
  • Year and Date: 2014-10-24
  • Invited
• [Presentation] Development of protein kinase-responsive system based on peptide- conformational change (2014)
  • Author(s): Yuta Nakamura, Sato Hikari, Tahara Yu, Yamamoto Tatsuhiro, Kishimura Akihiro, Mori Takeshi, Kinoshita Eiji, Koike Tohru and Katayama Yoshiki
  • Organizer: The 15th IUMRS-International Conference in Asia
  • Place of Presentation: 福岡市
  • Year and Date: 2014-08-24 – 2014-08-30
• [Presentation] 亜鉛の特性を利用したライフイノベーション (2014)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第8回 レドックス・ライフイノベーション第170委員会 & 第3回 JHUPO サテライト ジョイントシンポジウム
  • Place of Presentation: 宮崎市
  • Year and Date: 2014-08-22
  • Invited
• [Presentation] チオール含有生体分子を分離・濃縮するための亜鉛サイクレン磁気ビーズの開発 (2014)
  • Author(s): 河口真歩，Yuan Tianfei Elena，藤岡晴人，木下恵美子，木下英司，小池 透
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2014年会
  • Place of Presentation: つくば市
  • Year and Date: 2014-07-18
• [Presentation] リン酸化プロテオミスのための Phos-tag テクノロジー：サンプル前処理技術としての貢献 (2014)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第41回 BMS コンファレンス
  • Place of Presentation: 石川県羽咋郡
  • Year and Date: 2014-07-08
  • Invited
• [Presentation] トップダウンリン酸化プロテオミクスを指向したアフィニティー磁気ビーズの創出 (2013)
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 「修飾シグナル病」 第３回領域推進会議
  • Place of Presentation: 東京大学医科学研究所，東京
• [Presentation] タンパク質リン酸化修飾の高感度検出法と新しいオミクス技術としての展開
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 愛媛大学プロテオサイエンスセンター & JHUPO サテライト ジョイントシンポジウム（第２回）
  • Place of Presentation: 愛媛大学総合情報メディアセンター，松山市
  • Invited
• [Presentation] 次世代シグナル伝達研究のためのフォスタグテクノロジー
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 第86回日本生化学大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜，横浜市
• [Presentation] Phos-tag Biotin as an on-demand tool for study on protein phosphorylome
  • Author(s): Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, and Tohru Koike
  • Organizer: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜，横浜市
• [Presentation] Phosphorylation profiling of MAPK signaling cascade proteins by using neutral Phos-tag SDS-PAGE
  • Author(s): Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • Organizer: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜，横浜市
• [Presentation] Rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules by using a Phos-tag-based magnetic-bead method
  • Author(s): Masaya Tsunehiro, Yuma Meki, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • Organizer: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜，横浜市
• [Presentation] Quantitative analysis of effects of pH on the stability of His- and Asp-phosphoproteins in bacterial two-component system by using phosphate-affinity SDS-PAGE
  • Author(s): Akio Shiba, Keisuke Edahiro, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • Organizer: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜，横浜市
• [Presentation] Quantitative analysis of the phosphorylation state of a hybrid histidine kinase in bacterial two-component system by using phosphate-affinity SDS-PAGE
  • Author(s): Keisuke Edahiro, Akio Shiba, Emiko Kinoshita-Kikuta, Yuki Inoue, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • Organizer: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜，横浜市
• [Presentation] Phos-tag-Based Technological Advances for Studies on Signal Transductions in the Coming Generation
  • Author(s): Eiji Kinoshita
  • Organizer: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜，横浜市
  • Invited
• [Presentation] Ras/MAPK症候群および孤発性癌で認められるMEK遺伝子変異体の 異常活性化機構と疾患発症メカニズムの解明
  • Author(s): 久保田 裕二，木下 英司，武川 睦寛
  • Organizer: 第64回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [Presentation] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するための Phos-tag磁気ビーズの開発
  • Author(s): 常弘 昌弥, 目木 勇馬, 木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • Organizer: 第64回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [Presentation] ヒスチジン，アスパラギン酸のタンパク質リン酸化解析におけるチオリン酸基供与体（ATP-gS）利用の有用性の検討
  • Author(s): 芝 晃生，枝廣 圭祐，井上 裕希，木下 恵美子， 木下 英司，小池 透
  • Organizer: 第64回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [Presentation] ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼにおけるリン酸基転移反応の制御機構解析
  • Author(s): 枝廣 圭祐，芝 晃生，井上 裕希，木下 恵美子， 木下 英司，小池 透
  • Organizer: 第64回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [Presentation] 近接Phos-tagゲルを用いたリン酸化タンパク質の電気泳動法
  • Author(s): 目木 勇馬，木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • Organizer: 第64回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [Presentation] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するためのPhos-tag磁気ビーズの創製
  • Author(s): 常弘昌弥, 目木勇馬, 木下恵美子，木下英司, 小池 透
  • Organizer: 修飾シグナル病 第３回 公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学医科学研究所，東京
• [Presentation] ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼにおける リン酸基転移反応の制御機構
  • Author(s): 枝廣圭祐, 芝 晃生, 井上裕希，木下恵美子, 木下英司，小池 透
  • Organizer: 修飾シグナル病 第３回 公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学医科学研究所，東京
• [Presentation] Highly Sensitive Detection of Protein Phosphorylation by Phos-tag Technology
  • Author(s): Eiji Kinoshita
  • Organizer: 1st HiHA International Symposium
  • Place of Presentation: Hiroshima University, Higashi-Hiroshima
  • Invited
• [Presentation] Phos-tag を用いた解析技術
  • Author(s): 木下英司
  • Organizer: 大阪大学蛋白質研究所セミナー ～キナーゼ・シグナリング研究の進展～
  • Place of Presentation: 大阪大学蛋白質研究所，吹田市
  • Invited
• [Presentation] 亜鉛サイクレン磁気ビーズを用いたチオール化合物の精製
  • Author(s): 藤岡晴人，稗田雄三，常弘昌弥，木下恵美子，木下英司，小池 透
  • Organizer: 日本薬学会第134年会
  • Place of Presentation: 熊本市総合体育館，熊本市
• [Remarks] 広島大学大学院医歯薬保健学研究院医薬分子機能化学研究室
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/tkoike/index.html
• [Remarks] 新学術領域 修飾シグナル病
  • URL: http://shushoku-signal.com/soshiki/kobo/18kinoshita.html
• [Remarks] 広島大学大学院医歯薬保健学研究院医薬分子機能科学研究室
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/tkoike/index.html
• [Remarks] 新学術領域研究『修飾シグナル』
  • URL: http://shushoku-signal.com/soshiki/kobo/18kinoshita.html