無細胞蛋白質アレイによるポリユビキチン鎖依存シグナル伝達経路の網羅的同定と解析

• Project Area: Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation
• Project/Area Number: 25117719
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥10,660,000 (Direct Cost: ¥8,200,000、Indirect Cost: ¥2,460,000); Fiscal Year 2014: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2013: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
• Keywords: ユビキチン / 無脂肪タンパク質合成 / ポリユビキチン鎖 / プロテインアレイ / コムギ胚芽 / シグナル伝達

Outline of Annual Research Achievements

III.ポリユビキチン鎖相互作用シグナル伝達関連タンパク質の生化学的解析 ：本年度は、直鎖状ポリユビキチン鎖と相互作用するCYLDタンパク質に関与すE3リガーゼ（CYLD-E3リガーゼ）を中心に解析を進めた。その結果、in vitroでCYLD-E3リガーゼはCYLDと結合しK48型のポリユビキチン化することが分かった。

IV.LUBAC系による直鎖状ポリユビキチン鎖依存活性化キナーゼおよびE3リガーゼの細胞内解析 ：連携研究者の徳永先生により分与されたHOIPおよびHOIL(HOIP-HOIL)を細胞に導入する事で、直鎖ポリユビキ チン鎖を細胞内に形成させる事ができる。１）細胞内解析：培養細胞にHOIP-HOILと新規の直鎖状ポリユビキチン鎖依存活性化分子を共発現させ、上記 IIIで見出した反応が細胞内でも同様に起こるかどうか調べた。その結果、CYLDはCYLD-E3リガーゼ依存的に、細胞内でK48型ポリユビキチン化され分解されることが分かった。変異体解析によるCYLD上のユビキチン化部位の同定にも成功した。　２）NF-κBシグナルへの影響：CYLDはLUBAC依存的NF-κBを抑制することが知られている。そこで、NF-κBシグナルにおけるCYLD-E3リガーゼの役割についてpNF-κB-Lucを用いたルシフェラーゼアッセイにより解析した。その結果、CYLD-E3リガーゼはCYLDの分解を誘導することにより、NF-κBシグナルを促進することが明らかとなった。　３）細胞内局在：CYLD-E3リガーゼは主に、細胞質に局在することが分かった。TNFα処理による細胞内局在の変化は見られなかった。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] High-throughput synthesis of stable isotope-labeled transmembrane proteins for targeted transmembrane proteomics using a wheat germ cell-free protein synthesis system. (2015)
  • Author(s): Takemori N, Takemori A, Matsuoka K, Morishita R, Matsushita N, Aoshima M, Takeda H, Sawasaki T, Endo Y, Higashiyama S.
  • Journal Title: Mol Biosyst. Volume: 11 Issue: 2 Pages: 361-365
  • DOI: 10.1039/c4mb00556b
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] MAPK Phosphatase 5 Expression Induced by Influenza and Other RNA Virus Infection Negatively Regulates IRF3 Activation and Type I Interferon Response. (2015)
  • Author(s): James SJ, Jiao H, Teh HY, Takahashi H, Png CW, Phoon MC, Suzuki Y, Sawasaki T, Xiao H, Chow VT, Yamamoto N, Reynolds JM, Flavell RA, Dong C, Zhang Y.
  • Journal Title: Cell Rep. Volume: 10 Issue: 10 Pages: 1722-1734
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2015.02.030
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In situ visualization of plasma cells producing antibodies reactive to Porphyromonas gingivalis in periodontitis: The application of the enzyme-labeled antigen method. (2014)
  • Author(s): Mizutani Y, Tsuge S, Takeda H, Hasegawa Y, Shiogama K, Onouchi T, Inada KI, Sawasaki T, Tsutsumi Y.
  • Journal Title: Molecular Oral Microbiology Volume: In press Issue: 4 Pages: 156-173
  • DOI: 10.1111/omi.12052
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Involvement of Hepatitis C Virus NS5A Hyperphosphorylation Mediated by Casein Kinase I-α in Infectious Virus Production. (2014)
  • Author(s): Masaki T, Matsunaga S, Takahashi H, Nakashima K, Kimura Y, Ito M, Matsuda M, Murayama A, Kato T, Hirano H, Endo Y, Lemon SM, Wakita T, Sawasaki T, Suzuki T
  • Journal Title: J Virol Volume: 88(13) Issue: 13 Pages: 7541-55
  • DOI: 10.1128/jvi.03170-13
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Pctaire1/Cdk16 promotes skeletal myogenesis by inducing myoblast migration and fusion. (2014)
  • Author(s): Shimizu K, Uematsu A, Imai Y, Sawasaki T.
  • Journal Title: FEBS Lett. Volume: 588 Issue: 17 Pages: 3030-3037
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2014.05.060
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] creenCap3: Improving prediction of caspase-3 cleavage sites using experimentally verified noncleavage sites. (2014)
  • Author(s): Fu SC, Imai K, Sawasaki T, Tomii K.
  • Journal Title: Proteomics. Volume: 14 Issue: 17-18 Pages: 2042-2046
  • DOI: 10.1002/pmic.201400002
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Identification of RFPL3 protein as a novel E3 ubiquitin ligase modulating the integration activity of human immunodeficiency virus, type 1 preintegration complex using a microtiter plate-based assay. (2014)
  • Author(s): Tan BH, Suzuki Y, Takahashi H, Ying PH, Takahashi C, Han Q, Chin WX, Chao SH, Sawasaki T, Yamamoto N, Suzuki Y.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume: 289 Issue: 38 Pages: 26368-26382
  • DOI: 10.1074/jbc.m114.561662
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The apoptotic initiator caspase-8: its functional ubiquity and genetic diversity during animal evolution. (2014)
  • Author(s): Sakamaki K, Shimizu K, Iwata H, Imai K, Satou Y, Funayama N, Nozaki M, Yajima M, Nishimura O, Higuchi M, Chiba K, Yoshimoto M, Kimura H, Gracey AY, Shimizu T, Tomii K, Gotoh O, Akasaka K, Sawasaki T, Miller DJ.
  • Journal Title: Mol Biol Evol. Volume: 31 Issue: 12 Pages: 3282-3301
  • DOI: 10.1093/molbev/msu260
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Overexpression of the PAP1 transcription factor reveals a complex regulation of flavonoid and phenylpropanoid metabolism in Nicotiana tabacum plants attacked by Spodoptera litura. (2014)
  • Author(s): Mitsunami T., Nishihara M., Galis I., Alamgir K.M., Hojo Y., Fujita K., Sasaki N., Nemoto K., Sawasaki T., Arimura G.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 9 Issue: 9 Pages: e108849-e108849
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0108849
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The ligand binding ability of dopamine D1 receptors synthesized using a wheat germ cell-free protein synthesis system with liposomes. (2014)
  • Author(s): Arimitsu E, Ogasawara T, Takeda H, Sawasaki T, Ikeda Y, Hiasa Y, Maeyama K.
  • Journal Title: Eur J Pharmacol. Volume: 745 Pages: 117-122
  • DOI: 10.1016/j.ejphar.2014.10.011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Myosin phosphatase is inactivated by caspase-3 cleavage and phosphorylation of myosin phosphatase targeting subunit 1 during apoptosis. (2013)
  • Author(s): Iwasaki T, Katayama T, Kohama K, Endo Y, Sawasaki T.
  • Journal Title: Mol Biol Cell Volume: 24 Issue: 6 Pages: 748-756
  • DOI: 10.1091/mbc.e11-08-0740
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anti-interleukin-5 and multiple autoantibodies are associated with human atherosclerotic diseases and serum interleukin-5 levels (2013)
  • Author(s): Ishigami T, Abe K, Aoki I, Minegishi S, Ryo A, Matsunaga S, Matsuoka K, Taleda H, Sawasaki T, Umemura S, Endoh Y.
  • Journal Title: FASEB J Volume: 27 Issue: 9 Pages: 3437-45
  • DOI: 10.1096/fj.12-222653
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nek5, a novel substrate for caspase-3, promotes skeletal muscle differentiation by un-reaulatine casnase activity (2013)
  • Author(s): 清水康平、澤崎達也
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: Vol.587 Issue: 14 Pages: 2219-2225
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.05.049
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Suppression of DS1 phosphatidic acid phosphatase confirms resistance to Ralstonia solanacearum in Nicotiana benthamiana (2013)
  • Author(s): Masahiro Nakano, Masahiro Nishihara, Hirofumi Yoshioka, Kouhei Ohnishi, Yasufumi Hikichi, A kinori Kiba
  • Journal Title: PLoS One Volume: 8 Issue: 9 Pages: e75124-e75124
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0075124
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cell-free based protein array technology for analyses of protein kinases and ubiquitin ligases. (2013)
  • Author(s): Sawasaki T, Takeda H, Takahashi H, Nemoto K.
  • Journal Title: Seikagaku Volume: 85 Pages: 438-446
  • NAID: 10031184264
• [Presentation] 大規模生化学的解析はバイオインフォマティクス解析を凌駕するか？ (2014)
  • Author(s): 澤崎 達也
  • Organizer: 産総研・東京大学合同 創薬等支援技術基盤プラットフォーム(PDIS)ワークショップ ～実験とバイオインフォマティクスの協奏による構造生命科学～
  • Place of Presentation: 産総研臨海副都心センター別館（東京都江東区）
  • Year and Date: 2014-12-18
  • Invited
• [Presentation] コムギ無細胞技術を基盤とした化合物スクリーニング (2014)
  • Author(s): 澤崎 達也
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
  • Invited
• [Presentation] コムギ無細胞HTSを用いた創薬基盤技術 (2014)
  • Author(s): 澤崎 達也
  • Organizer: 第87回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都国際会議場（京都府京都市）
  • Year and Date: 2014-10-15 – 2014-10-18
  • Invited
• [Presentation] 無細胞技術を基盤とした自己抗体探索によるアンチエイジング医学のブレークスルーをめざして (2014)
  • Author(s): 澤崎 達也
  • Organizer: 第14回 日本抗加齢医学会総会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場（大阪府大阪市）
  • Year and Date: 2014-06-06 – 2014-06-08
  • Invited
• [Presentation] GPCR研究のためのコムギ無細胞系プロテオリポソーム技術 (2014)
  • Author(s): 澤崎 達也
  • Organizer: 第１１回GPCR研究会
  • Place of Presentation: 日本科学未来館 みらいCANホール（東京都江東区）
  • Year and Date: 2014-05-09 – 2014-05-10
  • Invited
• [Presentation] 創薬等プラットフォームにおけるコムギ無細胞基盤膜蛋白質生産と高親和膜蛋白質抗体作成技術 (2013)
  • Author(s): 澤崎 達也、竹田 浩之
  • Organizer: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取）
  • Invited
• [Presentation] コムギ無細胞蛋白質合成系を基盤とした膜タンパク質解析 (2013)
  • Author(s): 澤崎 達也、竹田 浩之
  • Organizer: 第65回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知）
  • Invited
• [Presentation] コムギ無細胞蛋白質合成系を基盤とした膜蛋白質の合成・精製と細胞への導入技術 (2013)
  • Author(s): 澤崎 達也, 竹田 浩之
  • Organizer: 第65回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知）
  • Invited
• [Presentation] 無細胞プロテインアレイを用いたプロテインキナーゼおよびユビキチンリガーゼの基質タンパク質探索技術 (2013)
  • Author(s): 澤崎 達也, 根本 圭一郎, 高橋 宏隆, 竹田 浩之
  • Organizer: 第86回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Invited
• [Presentation] コムギ無細胞蛋白質合成技術と乳がんバイオマーカー探索
  • Author(s): 澤崎 達也
  • Organizer: 日本プロテオーム学会主催プロテオサイエンスセンター JHUPOサテライトジョイントシンポジウム
  • Place of Presentation: 愛媛大学総合情報メデイアセンター・メディアホール
  • Invited
• [Remarks] CELL- FREE Technology
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/
• [Remarks] CELL-FREE Technology
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/pg02.html