チューブリンチロシンリガーゼとチューブリン複合体の構造解析

• Project Area: Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation
• Project/Area Number: 25117723
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tokyo Metropolitan University
• Principal Investigator: 三島 正規 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (70346310)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥9,620,000 (Direct Cost: ¥7,400,000、Indirect Cost: ¥2,220,000); Fiscal Year 2014: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2013: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
• Keywords: 微小管 / NMR / Ｘ線結晶構造解析 / ＴＴＬ / 構造解析 / TTL / Tubulin Tyrosine Ligase

Outline of Annual Research Achievements

微小管の化学修飾が種々の重要な生命現象に関与していることが近年明らかになってきている。そこでtubulin tyrosine ligase( TTL)の立体構造解析を行い、チューブリンのチロシン化のメカニズムをその立体構造に基づいて理解し、化学修飾による微小管動態制御の構造的基礎を得ることを目的に研究を行った。本研究において全長ヒトTTL1の大腸菌による発現系を構築し、精製系を確立した。大量に封入体を形成したことから、シャペロンの共発現系を用いた。これにより最終的な収量を約５倍にすることに成功した。13C,15N,2Hラベルした蛋白質を調製し、多次元NMR測定に取り組んだ。当初、NMR測定温度でTTL1が凝集を起こし、NMRスペクトルも極めて分離の悪いものであったが、buffer条件の検討を行い、現在までに測定温度で凝集が起こらず、NMR信号の分離のよい条件を見つけることができた。並行して、緑色蛍光タンパク質GFPとTTL1を 融合させることで、コロニーレベルでTTL1の安定を検討するシステムの開発にとりくんだ。ゼノパスのTTLの結晶構造をもとにゼノパスとヒトでの配列を比較することで、ヒトTTL1の変異体を作成したところ、安定性が劇的に向上した。この変異体についても13C,15N,2Hラベルした蛋白質を調製し、多次元NMR測定に取り組んだ。またアルファチューブリンのC末端領域の発現系を構築、標識試料を調製し、NMRチューブ内でチロシン化反応を行い、リアルタイムでのTTLの活性をモニターする系を確立した。またヒトTTL1のＸ線結晶構造解析のため、変異体を用いて結晶化を行った。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Evaluation of the reliability of the maximum entropy method for reconstructing 3D and 4D NOESY-type NMR spectra of proteins. (2015)
  • Author(s): Shigemitsu, Y., Ikeya, T., Yamamoto, A., Tsuchie, Y., Mishima, M., Smith, B. O., Guentert, P. & Ito, Y.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 457 Issue: 2 Pages: 200-205
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.12.088
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] 転写補因子の複合体形成におけるCK2によるリン酸化の分子スイッチとしての役割 (2015)
  • Author(s): 三島正規、小林彩保、金場哲平
  • Journal Title: 生化学 Volume: 87 Pages: 258-261
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficient and cost effective production of active-form human PKB using silkworm larvae. (2014)
  • Author(s): R. Maesaki, R. Satoh, M. Taoka, T. Kanaba, T. Asano, C. Fujita, T. Fujiwara, Y. Ito, T. isobe, T. Hakoshima, K. Maenaka, and M. Mishima
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 4 Issue: 1 Pages: 6016-6016
  • DOI: 10.1038/srep06016
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 転写抑制補助因子のcasein kinase 2によるリン酸化と転写制御 (2014)
  • Author(s): 小林彩保、金場哲平、三島正規
  • Journal Title: 細胞工学 Volume: 33 Pages: 656-657
• [Journal Article] Structural insights into the recruitment of SMRT by the corepressor SHARP under phosphorylative regulation. (2014)
  • Author(s): Mikami S, Kanaba T, Takizawa N, Kobayashi A, Maesaki R, Fujiwara T, Ito Y,Mishima M.
  • Journal Title: Structure. Volume: 22 Issue: 1 Pages: 35-46
  • DOI: 10.1016/j.str.2013.10.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Microtubule-binding sites of the CH domain of EBl and its autoinhibition revealed by NMR. (2013)
  • Author(s): Kanaba T, Maesaki R, Mori T, I to Y, Hakoshima T, Mishima M.
  • Journal Title: Biochim Biophys Acta. Volume: 1834 Issue: 2 Pages: 499-507
  • DOI: 10.1016/j.bbapap.2012.10.013
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High-resolution heteronuclear multidimensional NMR of proteins living insect cells using a baculovirus protein expression system ≪ (2013)
  • Author(s): Jumpei Hamatsu, Daniel O'Donovan, Takashi Tanaka, Takahiro Shirai, Yuichiro Hourai, Tsutomu Mikawa, Teppei Ikeya, Masaki Mishima, Wayne Boucher, Brian O. Smith, Ernest D. Laue, Masahiro Shirakawa, Yutaka Ito 4
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 135 Issue: 5 Pages: 1688-1691
  • DOI: 10.1021/ja310928u
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Divergent DNA-binding specificities of a group of ETHYLENE RESPONSE FACTOR transcription factors involved in plant defense. (2013)
  • Author(s): Shoji T, Mishima M, Hashimoto T.
  • Journal Title: Plant Physiol. Volume: 162 Issue: 2 Pages: 977-990
  • DOI: 10.1104/pp.113.217455
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure of the second RRM domain of Nrd1, a fission yeast MAPK target RNA binding protein, and implication for its RNA recognition and regulation. (2013)
  • Author(s): Kobayashi A, Kanaba T, Satoh R, Fujiwara T, Ito Y, Sugiura R, Mishima M.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 437 Issue: 1 Pages: 12-17
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.06.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An in-cell NMR study of monitoring stress-induced increase of cytosolic Ca2+ concentration in HeLa cells (2013)
  • Author(s): Dambarudhar Shiba Sankar Hembrama, Takahiro Haremakia, Jumpei Hamatsua, Jin Inouea, Hajime Kamoshidaa, Teppei Ikeyaa, Masaki Mishimaa, Tsutomu Mikawab, Nobuhiro Hayashic, Masahiro Shirakawad, Yutaka Ito
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 438 Issue: 4 Pages: 653-659
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.07.127
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] RNA結合蛋白質Nrd1のNMR法による構造解析 (2014)
  • Author(s): 小林彩保、中西絢子、佐藤亮介、藤原俊伸、伊藤隆、杉浦麗子、三島正規
  • Organizer: 日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [Presentation] NMRを用いた溶液中のマルチドメインタンパク質Protein Kinase Cの構造解析 (2014)
  • Author(s): 金場 哲平、宮田 和舞、前崎 綾子、伊藤 隆、三島 正規
  • Organizer: 日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [Presentation] NMRとSAXSによるマルチドメインタンパク質の構造解析 (2014)
  • Author(s): 三島 正規
  • Organizer: 第５３回NMR討論会
  • Place of Presentation: 吹田
  • Year and Date: 2014-11-14 – 2014-11-16
• [Presentation] In-cell NMRを志向したDOTA-M8リガンドの合成研究 (2014)
  • Author(s): 彦根 佑哉，平井 剛，袖岡 幹子，三島 正規，伊藤 隆
  • Organizer: 第５３回NMR討論会
  • Place of Presentation: 吹田
  • Year and Date: 2014-11-14 – 2014-11-16
• [Presentation] 擬コンタクトシフト情報収集のための、種々のランタノイド結合タグの検討 (2014)
  • Author(s): 飯沼 純弥，金場 哲平，小林 彩保，伊藤 隆，三島 正規
  • Organizer: 第５３回NMR討論会
  • Place of Presentation: 吹田
  • Year and Date: 2014-11-14 – 2014-11-16
• [Presentation] 溶液状態におけるRNA結合タンパク質Nrd1の構造解析 (2014)
  • Author(s): 小林 彩保、中西 絢子、佐藤 亮介、藤原 俊伸、伊藤 隆、杉浦 麗子、三島 正規
  • Organizer: 第５３回NMR討論会
  • Place of Presentation: 吹田
  • Year and Date: 2014-11-14 – 2014-11-16
• [Presentation] MAPKによりリン酸化されるRNA結合タンパク質Nrd1の溶液構造解析 (2014)
  • Author(s): 小林 彩保、中西 絢子、佐藤 亮介、藤原 俊伸、伊藤 隆、杉浦 麗子、三島 正規
  • Organizer: 第3回修飾シグナル病若手ワークショップ
  • Place of Presentation: 神奈川県足柄下郡
  • Year and Date: 2014-09-30 – 2014-10-02
• [Presentation] Structural studies of the RNA-binding protein Nrd1, a MAPK-target multi-domain protein using NMR and SAXS (2014)
  • Author(s): Masaki Mishima
  • Organizer: The 5th Japan-Taiwan Bilateral NMR Symposium
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2014-09-29 – 2014-09-30
• [Presentation] RNA 結合蛋白質Nrd1 のNMR を用いた構造解析 (2014)
  • Author(s): 小林 彩保、中西 絢子、佐藤 亮介、藤原 俊伸、伊藤 隆、杉浦 麗子、三島 正規
  • Organizer: RNAフロンティアミーティング2014
  • Place of Presentation: 和歌山県西牟婁郡
  • Year and Date: 2014-09-16 – 2014-09-18
• [Presentation] NMR and SAXS analyses of the RNA-binding protein Nrd1, a MAPK-target multi-domain protein (2014)
  • Author(s): Ayaho Kobayashi, Ryosuke Satoh, Yutaka Ito, Reiko Sugiura Masaki Mishima
  • Organizer: ICMRBS
  • Place of Presentation: Dallas, USA
  • Year and Date: 2014-08-24 – 2014-08-29
• [Presentation] RNA結合蛋白質Nrd1の溶液状態における構造解析 (2014)
  • Author(s): 小林 彩保、佐藤 亮介、藤原 俊伸、伊藤 隆、杉浦 麗子、三島 正規
  • Organizer: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-06-25 – 2014-06-27
• [Presentation] RNA結合蛋白質 Nrd1の NMR法による構造解析 (2013)
  • Author(s): 小林彩保, 佐藤亮介, 藤原俊伸, 伊藤隆, 杉浦麗子, 三島正規
  • Organizer: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 鳥取
• [Presentation] NMRを用いた溶液中のマルチドメインタンパク質 PKCの構造解析の試み (2013)
  • Author(s): 金場哲平, 秋吉克昂, 前崎綾子, 宮崎健介, 伊藤隆, 三島正規
  • Organizer: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 鳥取
• [Presentation] 分裂酵母由来の MAP キナーゼによりリン酸化される RNA 結合タンパク質 Nrd1 の構造解析 (2013)
  • Author(s): Kobayashi A., Satoh R., Fujiwara T., Sugiura R., Ito Y., Mishima M
  • Organizer: 第 51 回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 京都
• [Presentation] MAPキナーゼによりリン酸化されるRNA結合タンパク質Nrd1の構造解析 (2013)
  • Author(s): 小林彩保, 佐藤亮介, 藤原俊伸, 伊藤隆, 杉浦麗子, 三島正規
  • Organizer: 第52回 NMR討論会
  • Place of Presentation: 金沢
• [Presentation] マルチドメインタンパク質Protein kinase Cの構造解析の試み (2013)
  • Author(s): 金場哲平, 矢巻菜央, 秋吉克昂, 前崎綾子, 宮崎健介, 伊藤隆, 三島正規
  • Organizer: 第52回 NMR討論会
  • Place of Presentation: 金沢
• [Book] 細胞工学 （転写抑制補助因子のcasein kinase 2によるリン酸化と転写制御） (2014)
  • Author(s): 小林彩保、金場哲平、三島正規
  • Publisher: 学研メディカル秀潤社