液胞を標的とした酸化還元状態感受性蛍光タンパク質の開発
Publicly Offered Research
| Project Area | Environmental sensing of plants: Signal perception, processing and cellular responses |
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| Project/Area Number |
25120713
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岩田 達也 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (20569917)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2014)
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| Budget Amount *help |
¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
Fiscal Year 2014: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2013: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
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| Keywords | フラビン / 蛍光タンパク質 / LOVドメイン / 酸化還元反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「酸性環境下で機能する蛍光タンパク質の大腸菌によるスクリーニング」：ペリプラズム領域に発現させた蛍光タンパク質は、細胞質内に発現させたものより外液のpH環境に敏感に反応し（殆ど外部のpHと同じになる）、このスクリーニング系で蛍光タンパク質のスクリーニングを行っていった。
シロイヌナズナphot2-LOV2のC426A（C/A）のペリプラズム発現について同様に行ったが、ペリプラズム発現のC/AはFMNを結合していない可能性が示唆されたため、培養液にFMNやリボフラビンを加えることでペリプラズムでのホロタンパク質の発現を目指した。しかしながら、GFP、LOVの両方について、蛍光励起・発光スペクトル、酸性条件に対する挙動など、野生型と明らかに異なる蛍光特性を示す変異体の単離には至らなかった。
「LOVドメインのシステイン残基の位置のアミノ酸がFMNの光還元反応に及ぼす影響」：LOVドメインのシステイン残基の位置のアミノ酸がFMNの反応を決定していることから、この位置のアミノ酸をアラニン以外に変え、その影響を調べた。シロイヌナズナphot2-LOV2のC426DとC426K変異体はFMNが結合しなかったが、C426N（C/N）、C426G（C/G）、C426S（C/S）変異体にはFMNが結合した。これらの変異体は全てC/A変異体と同じく還元剤非存在下で光還元反応（FMNH•の生成）を示すことが分かった。一方、光還元の効率はアミノ酸によって違いを示し、アラニンが最も還元されやすく、次いでセリン、アスパラギン、グリシンの順で還元されにくいことが分かった。この結果は、C/AではなくC/NやC/G変異体にするとより退色の少ない蛍光タンパク質の作成が出来る可能性を示している。また、フォトトロピンの機能を完全に消失させるためにも、C/NやC/Gにする方がいいかもしれない。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(2 results)
Research Products
(28 results)
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[Presentation] Functional conversion of (6-4) photolyase and CPD photolyase2014
Author(s)
Daichi Yamada, Junpei Yamamoto, Tomoko Ishikawa, Tomohiro Suzuki, I M. Mahaputra Wijaya, Tatsuya Iwata, Elizabeth D. Getzoff, Takeshi Todo, Shigenori Iwai, and Hideki Kandori
Organizer
The 52nd Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
Place of Presentation
Sapporo
Year and Date
2014-09-25 – 2014-09-27
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