ヘムをシグナリング分子とする情報伝達システムの構造化学的基盤

Publicly Offered Research

Project Area	Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
Project/Area Number	25121701
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Biological Sciences
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	石森浩一郎北海道大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (20192487)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2015-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2014)
Budget Amount *help	¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 2014: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000) Fiscal Year 2013: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Keywords	ヘム / 金属蛋白質 / 生体金属 / 鉄代謝 / 構造解析
Outline of Annual Research Achievements	IRP制御複合体の蛋白質間相互作用解析　IRPと複合体を形成すると考えられるmRNAのIREに対する結合特性，および，ヘムによるIRE結合阻害効果を検討した。その結果，ゲルシフトアッセイでは，その蛋白質としての安定性が低いため，明確な結果が得られなかったIRP2のIRE親和性について，その解離定数はIRP1のおよそ50％程度の0.013 mMであることが示された。さらに，そのヘムによる阻害効果はついては，1当量のヘムの添加で明確な阻害効果が観測され，阻害効果が現れるまでに数当量のヘムが必要なIRP1に比べ，IRP2のほうが低濃度のヘムによって阻害がかかることが示された。このことは細胞内においてIRP2が主な鉄濃度センサーとして機能していることとも対応している。さらに，IRPのIREからの解離に関しては，精製蛋白質を用いた実験では，数十当量のヘムの添加が必要であり，細胞内においてはヘムシャペロンによるIRPへのヘムの輸送および添加と，そのヘム結合によるIRPのIREからの解離が示唆された。一方，細胞内において，鉄高濃度時にIRPと相互作用することでIRPをユビキチン化し，最終的にはその蛋白質分解を促進するFBXL-5蛋白質についても，その大量精製系の確立を試みた。種々のプロモーターの検討の結果，大腸菌としてRosetta (DE3)pLysSを用い，MBPとの融合蛋白質として発現するのが最も収量が多いことを見出し，FBXL-5の大量精製系を確立することに成功した。制御系に関連した蛋白質の探索とその機能解析　IRPへヘムを輸送，供与する蛋白質を同定するため，IRPと相互作用する蛋白質の探索を試みた。探索系としては，酵母菌を用いたtwo-hybrid systemと，ヘムを磁気ビーズに結合させた手法について検討を行った。
Research Progress Status	26年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	26年度が最終年度であるため、記入しない。