医学上重要なGPCRのシグナル制御機構の構造生物学的解明

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 25121708
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 上田 卓見 東京大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (20451859)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2014: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2013: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: 膜蛋白質 / NMR / GPCR / 構造生物学

Outline of Annual Research Achievements

muオピオイド受容体を昆虫細胞に発現させて、SDS-PAGEで90%以上の純度となるまで精製した。得られたmuオピオイド受容体が、NMR測定の間リガンド結合活性を保持していることを確認した。また、得られたmuオピオイド受容体を再構成高密度リポ蛋白質の脂質二重膜中に再構成した上で、アゴニスト存在下において、G蛋白質のGDP-GTP交換およびGRKによるSer377のリン酸化を促進することを確認した。
次に、部分重水素化およびメチオニン残基選択標識を施した、界面活性剤に可溶化したmuオピオイド受容体を調製した上で、アンタゴニストおよび完全アゴニスト添加して1H-13C HMQCスペクトルを取得した。その結果、概ねオピオイド受容体のメチオニン残基数に対応するシグナルが観測された。次に、各メチオニン残基の変異体のスペクトルを取得して、変異導入前のスペクトルと比較することにより、シグナルを帰属した。
次に、部分アゴニストを添加した状態における、1H-13C HMQCスペクトルを取得した。その結果、アンタゴニスト結合状態と化学シフトが同じシグナルと、完全アゴニスト結合状態と化学シフトが同じシグナルが両方観測された。各リガンド結合状態における両シグナルの強度比が、上記のアッセイにより決定したefficacyと良く対応していたことから、オピオイド受容体が細胞内のキャビティが閉じた不活性化状態とキャビティが開いた活性化状態の構造平衡にあることが示された。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Development of a method for reconstruction of crowded NMR spectra from undersampled time-domain data (2015)
  • Author(s): Ueda T, Yoshiura C, Matsumoto M, Kofuku Y, Okude J, Kondo K, Shiraishi Y, Takeuchi K, Shimada I
  • Journal Title: J. Biomol. NMR Volume: 印刷中 Issue: 1 Pages: 31-41
  • DOI: 10.1007/s10858-015-9908-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Functional dynamics of deuterated β2 -adrenergic receptor in lipid bilayers revealed by NMR spectroscopy (2014)
  • Author(s): Kofuku Y, Ueda T, Okude J, Shiraishi Y, Kondo K, Mizumura T, Suzuki S, Shimada I
  • Journal Title: Angew Chem Int Ed Engl Volume: 53 Issue: 49 Pages: 13376-13379
  • DOI: 10.1002/anie.201406603
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Cross-saturation and transferred cross-saturation experiments (2014)
  • Author(s): Ueda T, Takeuchi K, Nishida N, Stampoulis P, Kofuku Y, Osawa M, Shimada I
  • Journal Title: Q Rev Biophys Volume: 47 Issue: 2 Pages: 143-187
  • DOI: 10.1017/s0033583514000043
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Functional dynamics of cell surface membrane proteins (2014)
  • Author(s): Nishida N, Osawa M, Takeuchi K, Imai S, Stampoulis P, Kofuku Y, Ueda T, Shimada I
  • Journal Title: J Magn Reson Volume: 241 Pages: 86-96
  • DOI: 10.1016/j.jmr.2013.11.007
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] NMRによる、限定されたデータからのGPCRの動的構造情報の抽出 (2014)
  • Author(s): 上田 卓見
  • Organizer: 第14回蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-06-25 – 2014-06-27
  • Invited
• [Presentation] 二次元NMRインターフェログラム再構成法の開発およびCCR5のMIP-1a結合様式の解明への応用 (2014)
  • Author(s): 上田卓見、吉浦知絵、松本昌彦、幸福裕、奥出順也、近藤啓太、白石勇太郎、嶋田一夫
  • Organizer: 日本薬学会第134年会
  • Place of Presentation: 熊本県・熊本市総合体育館
  • Year and Date: 2014-03-27 – 2014-03-30
• [Presentation] NMRを用いた過渡的蛋白質－蛋白質複合体の結合様式の解明 (2014)
  • Author(s): 上田 卓見
  • Organizer: 大阪大学蛋白質研究所セミナー "結晶構造を併用したハイブリッド構造研究の最前線"
  • Place of Presentation: 大阪府・大阪大学蛋白質研究所
  • Year and Date: 2014-02-07 – 2014-02-08
  • Invited
• [Presentation] NMRによるGタンパク質共役型受容体の機能解明 (2013)
  • Author(s): 上田 卓見
  • Organizer: 第4回 神経科学と構造生物学の融合研究会
  • Place of Presentation: 愛知県・岡崎コンファレンスセンター
  • Year and Date: 2013-11-19 – 2013-11-20
  • Invited
• [Remarks]
• [Remarks]