バクテリアべん毛蛋白質輸送スイッチの分子基盤

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 25121718
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 南野 徹 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (20402993)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000); Fiscal Year 2014: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2013: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
• Keywords: 蛋白質 / 細菌 / 電子顕微鏡 / 分子モーター / 生物物理

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、X 線結晶構造解析と極低温電子線トモグラフィー法による構造解析を組み合わせることで、フック完成シグナルに伴う輸送装置の基質認識モード切り替え機構を原子レベルで解明することを目指している。本年度の主な成果は以下に示す。
1.FlhAC(F459A)およびFlhAC(T490M)の結晶構造の精密化を行い、野生型FlhACの構造と比較した結果、野生型FlhAC はsemi-closed 構造をとっていたのに対し、FlhAC(F459A)およびFlhAC(T490M)はOpen構造をとっていることが判明した。さらに、FlhAcとそのN末膜貫通領域とをつなぐリンカーが伸びている向きがsemi-closed 構造とopen構造の間で異なっていることが明らかとなった。
2.比較的安定なFlgN/FlgK/FlhAc/FliJ複合体を単離精製することができた。
3.サルモネラ由来のFlgNの結晶構造から、細菌の間で高く保存されているAsp-92, Asp-95, Ile-103がα3ヘリックスの同一面上に存在していた。そこで、これらのアミノ酸残基をアラニンに置換すると、FlgKに対する結合親和性が顕著に低下した。これら３残基を同時にアラニンに置換すると、FlgKに全く結合できなくなった。このことから、Asp-92, Asp-95, Ile-103がFlgKとの相互作用に直接関与していることが示唆された。さらに、FlgNのα1ヘリックスとα2ヘリックスの間に位置するループ構造がFlgNの輸送シャペロン活性を制御する構造スイッチとして働いていることが明らかとなった。
4.サルモネラからべん毛蛋白質輸送活性を示す反転小胞膜の調製に成功した。クライオ電子線トモグラフィー法によりべん毛基部体MS-Cリング複合体の内部に輸送装置が存在することが確認できた。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Protein export through the bacterial flagellar type III export pathway. (2014)
  • Author(s): Minamino, T.
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta. Volume: 1843 Issue: 8 Pages: 1642-1648
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2013.09.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the periplasmic domain of FliP, an integral membrane component of the bacterial flagellar type III protein-export apparatus (2014)
  • Author(s): Fukumura T, Furukawa Y, Kawaguchi T, Saijo-Hamano Y, Namba K, Imada K, Minamino T
  • Journal Title: Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. Volume: 70(Pt 9) Issue: 9 Pages: 1215-1218
  • DOI: 10.1107/s2053230x14014678
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Assembly dynamics and the roles of FliI ATPase of the bacterial flagellar export apparatus. (2014)
  • Author(s): Bai, F.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 4 Issue: 1 Pages: 6528-6528
  • DOI: 10.1038/srep06528
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The bacterial flagellar protein export apparatus processively transports flagellar proteins even with extremely infrequent ATP hydrolysis. (2014)
  • Author(s): Minamino, T.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 4 Issue: 1 Pages: 7579-7579
  • DOI: 10.1038/srep07579
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structure and function of the bi-directional bacterial flagellar motor. (2014)
  • Author(s): Morimoto VY, Minamino T.
  • Journal Title: Biomolecules Volume: 4 Issue: 1 Pages: 217-234
  • DOI: 10.3390/biom4010217
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Assembly and stoichiometry of FliF and FlhA in Salmonella flagellar basal body. (2014)
  • Author(s): Morimoto YV, Ito M, Hiraoka KD, Che Y-S, Bai F, Kami-ike N, Namba K, Minamino T.
  • Journal Title: Mol. Microbiol. Volume: 91 Issue: 6 Pages: 1214-1226
  • DOI: 10.1111/mmi.12529
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Common evolutionary origin for the rotor domain of rotary ATPases and Flagellar protein export apparatus. (2013)
  • Author(s): Kishikawa, J., et al
  • Journal Title: PLoS One Volume: 8 Issue: 5 Pages: 64692013-64692013
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0064695
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interactions of bacterial flagellar chaperone-substrate complexes with FlhA contribute to coordinating assembly of the flagellar filament. (2013)
  • Author(s): Kinoshita M, Hara N, Imada K, Namba K, Minamino T.
  • Journal Title: Mol. Microbiol. Volume: 90 Issue: 6 Pages: 1249-1261
  • DOI: 10.1111/mmi.12430
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body (2013)
  • Author(s): Kawamoto, A., Morimoto, Y.V., Miyata, T., Minamino, T., Hughes, K.T., Kato, T. & Namba, K.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 3 Issue: 1 Pages: 3369-3369
  • DOI: 10.1038/srep03369
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 細菌べん毛のIII型分泌装置の再構築 (2015)
  • Author(s): Terashima, H.
  • Organizer: 第88回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 長良川国際会議場（岐阜県）
  • Year and Date: 2015-03-26
  • Invited
• [Presentation] べん毛蛋白質輸送システムのロバストネスを支える分子機構 (2015)
  • Author(s): Minamino, T.
  • Organizer: 2014年度べん毛研究交流会
  • Place of Presentation: 合歓の郷リゾートホテル（三重県）
  • Year and Date: 2015-03-02
• [Presentation] Identification of a structural switch of FlgN to control its chaperone activity. (2015)
  • Author(s): Kinoshita, M.
  • Organizer: 2014年度べん毛研究交流会
  • Place of Presentation: 合歓の郷リゾートホテル（三重県）
  • Year and Date: 2015-03-02
• [Presentation] Identification of a structural switch of FlgN to control its chaperone activity. (2015)
  • Author(s): Kinoshita, M.
  • Organizer: HFSP Japan meeting
  • Place of Presentation: ルスツリゾート（北海道）
  • Year and Date: 2015-02-24
• [Presentation] Structural characterization of FliP, a component of the type III flagellar protein export apparatus (2015)
  • Author(s): Fukumura, T.
  • Organizer: BLAST XIII
  • Place of Presentation: Hilton Tucson East, Arizona, USA
  • Year and Date: 2015-01-18 – 2015-01-23
• [Presentation] バクテリアべん毛輸送におけるFliI ATPaseの作用機構 (2015)
  • Author(s): Minamino, T.
  • Organizer: 2015年生体運動班会議
  • Place of Presentation: 学習院大学（東京）
  • Year and Date: 2015-01-09
• [Presentation] べん毛III型輸送シャペロンFlgNの構造とFlhAとの相互作用 (Structure of FlgN, a flagellar type III export chaperone, and its interaction with FlhA, a flagellar type III export gate protein.) (2014)
  • Author(s): Ogawa, Y.
  • Organizer: 第52回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道）
  • Year and Date: 2014-09-25
• [Presentation] 細菌III型分泌装置のin vitro輸送再構成系の構築 (Construction of an in vitro transport assay system for the bacterial type III protein secretion) (2014)
  • Author(s): Terashima, H.
  • Organizer: 第52回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道）
  • Year and Date: 2014-09-25
• [Presentation] In situ structures of Salmonella injectisome and flagellar type III secretion systems by electron cryotomography. (2014)
  • Author(s): Kawamoto, A.
  • Organizer: 2014 International Biophysics Congress
  • Place of Presentation: Brisbane Convention & Exhibition Centre, Brisbane, Australia
  • Year and Date: 2014-08-04
• [Presentation] バクテリアべん毛蛋白質輸送ゲート構成因子FliPペリプラズムドメインのX線結晶構造解析. (2014)
  • Author(s): Fukumura, T.
  • Organizer: 第11回21世紀大腸菌研究会
  • Place of Presentation: ホテル大観（岩手県）
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-06
• [Presentation] Evolution of a robust protein export system for bacterial flagellar assembly (2014)
  • Author(s): Minamino, T.
  • Organizer: GRC on Sensory Transduction in Microorganisms
  • Place of Presentation: Ventura Beach Marriott (CA, USA)
• [Presentation] Role of FliI ATPase in bacterial flagellar protein export (2014)
  • Author(s): Minamino, T.
  • Organizer: 第19回べん毛研究交流会
  • Place of Presentation: 県立広島大学サテライトキャンパス（広島県）
• [Presentation] Structure of the flagellar type III export chaperone, FlgN (2014)
  • Author(s): Nakanishi Y
  • Organizer: 第19回べん毛研究交流会
  • Place of Presentation: 県立広島大学サテライトキャンパス（広島県）
• [Presentation] Conformational change of a cytoplasmic fragment of FlhA, a flagellar type III protein export apparatus protein (2014)
  • Author(s): Ogawa Y
  • Organizer: 第19回べん毛研究交流会
  • Place of Presentation: 県立広島大学サテライトキャンパス（広島県）
• [Presentation] Interaction of bacterial flagellar chaperones with an export gate protein FlhA (2014)
  • Author(s): Kinoshita, M.
  • Organizer: 第19回べん毛研究交流会
  • Place of Presentation: 県立広島大学サテライトキャンパス（広島県）
• [Presentation] X-ray structure of the periplasmic domain of FliP, a component of the flagellar protein export apparatus (2014)
  • Author(s): Fukumura, T.
  • Organizer: 第19回べん毛研究交流会
  • Place of Presentation: 県立広島大学サテライトキャンパス（広島県）
• [Presentation] Architecture of the Salmonella type III secretion system by electron cryotomography (2014)
  • Author(s): Kawamoto, A.
  • Organizer: 第19回べん毛研究交流会
  • Place of Presentation: 県立広島大学サテライトキャンパス（広島県）
• [Presentation] べん毛III型輸送装置蛋白質FlhAの細胞質領域の構造変化
  • Author(s): 小川雄也
  • Organizer: 第86回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（横浜）
• [Presentation] Conformational change of a cytoplasmic fragment of FlhA, a flagellar type III protein export apparatus protein
  • Author(s): Ogawa, Y.
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府）
• [Presentation] Crystallization and genetic analyses of a Periplasmic loop of FliP, a component of the flagellar protein export apparatus
  • Author(s): Fukumura, T.
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府）
• [Presentation] Construction of an in vitro assay system for the bacterial flagllar protein export.
  • Author(s): Terashima, H.
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府）
• [Presentation] Mutational robustness of FlhA, a subunit of the bacterial flagellar export apparatus
  • Author(s): Minamino, T.
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府）
• [Presentation] サルモネラ菌ニードル複合体およびべん毛III型分泌装置の細胞内機能構造
  • Author(s): 川本晃大
  • Organizer: 第87回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京都）
• [Book] Encyclopedia of Biophysics (2013)
  • Author(s): Minamino, T.
  • Publisher: Springer
• [Remarks] 大阪大学大学院生命機能研究科プロトニックナノマシン研究室
  • URL: http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/jpn/general/lab/02/
• [Remarks] プロトニックナノマシン研究室（難波教授）/大阪大学大学院生命機能研究科
  • URL: http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/jpn/general/lab/02/