水素重水素交換質量分析によるタンパク質間相互作用解析の高速・高分解能化

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 25121722
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 内山 進 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (90335381)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2014: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2013: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: 分子間相互作用 / タンパク質 / 質量分析 / 超遠心分析 / 立体構造 / 相互作用部位 / DNA

Outline of Annual Research Achievements

最終年度である本年は、既に得られたSMC2/SMC4ヘテロダイマーの結晶データの精密解析、不足データの追加、HDX-MSデータの再解析、さらには論文の取り纏めを行った。まず、昨年度決定した結晶構造の精密化を行い1.89オングストロームでの結晶構造決定とすることに成功した。これにより、真核生物においては原核生物と異なりSMC2/SMC4がヘテロダイマー形成するが、この分子基盤を明らかとすることが出来た。また、これまでに報告されていたSMCの立体構造とは異なり、2本のコイルドコイルは並行となっており、そのため、ヒンジ領域でDNAと結合すると考えられている部位は露出していないことが明らかとなった。実際に、ヘテロダイマーは二本鎖DNAとは結合しないことが確認出来た。一方、ヘテロダイマーは一本鎖DNAとは結合することが確認出来たことから、一本鎖DNAとの結合についてHDX-MS解析を進めた。その結果、ヒンジの外側部分に重水素交換速度の低下が観測され、さらにヘテロダイマー形成に関与するヒンジの内側部分に速度の上昇が観測された。これらの結果は、ヒンジの外側部分にに一本鎖DNAが結合すること、さらに結合に伴ってヒンジの内側部分に構造変化が起こったことを意味していると解釈出来る。以上の結果を、取りまとめて、論文の投稿を行った。現在、審査中である。
また、領域内共同研究として、東京大学の大戸らと自然免疫に関与するタンパク質TLR9の溶液中での相互作用状態の解析を超遠心分析を用いて行った。その結果、特定のDNAとの結合によりTLR9は二量体化することが確認出来、さらに、その2量体化の解離定数は20μM程度であることが明らかとなった。成果は2014年12月にNature誌にアクセプトされた。さらに、北海道大学の前仲とは免疫に関与するタンパク質LLT1に関する超遠心分析を行い、EJI誌に受理された。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structure of extracellular domain of human lectin-like transcript 1 (LLT1), the ligand for natural killer receptor-P1A. (2015)
  • Author(s): Kita S, Matsubara H, Kasai Y, Tamaoki T, Okabe Y, Fukuhara H, Kamishikiryo J, Krayukhina E, Uchiyama S, Ose T, Kuroki K, Maenaka K.
  • Journal Title: Eur. J. Immunol. Volume: 印刷中 Issue: 6 Pages: 1605-1613
  • DOI: 10.1002/eji.201545509
  • NAID: 120005906772
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structural basis for PPARgamma transactivation by endocrine disrupting organotin compounds. (2015)
  • Author(s): Harada, S., Hiromori, Y., Nakamura, S., Kawahara, K., Fukakusa, S., Maruno, T., Noda, M., Uchiyama, S., Fukui, K., Nishikawa, J., Nagase, H., Kobayashi, Y., Yoshida, T., Ohkubo, T., Nakanishi, T.,
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 5:8520 Issue: 1 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1038/srep08520
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structural basis of CpG and inhibitory DNA recognition by Toll-like receptor 9. (2015)
  • Author(s): Ohto, U., Shibata, T., Tanji, H., Krayukhina, E., Uchiyama, S., Miyake, K., and Shimizu, T.
  • Journal Title: Nature Volume: 520 Issue: 7549 Pages: 702-705
  • DOI: 10.1038/nature14138
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Pepsin immobilization on an aldehyde-modified polymethacrylate monolith and its application for protein analysis (2014)
  • Author(s): Han, W., Yamauchi, M., Hasegawa, U., Noda, M., Fukui, K., van der Vlies, Uchiyama, S., and Uyama, H.
  • Journal Title: J. Biosci. Bioeng. Volume: 119 Issue: 5 Pages: 505-510
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2014.10.018
  • NAID: 110009962601
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] An archaeal homolog of proteasome assembly factor functions as a proteasome activator (2013)
  • Author(s): Kumoi K, Satoh T, Murata K, Hiromoto T, Mizushima T, Kamiya Y, Noda M, Uchiyama S, Yagi H, Kato K.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of the novel Trypanosoma brucei inosine 5'-monophosphate dehydrogenase. (2013)
  • Author(s): Bessho T, Morii S, Kusumoto T, Shinohara T, Noda M, Uchiyama S, Shuto S, Nishimura S, Djikeng A, Duszenko M, Martin SK, Inui T, Kubata KB.
  • Journal Title: Parasitology Volume: 140 Pages: 735-745
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] SuperNova, a monomeric photosensitizing fluorescent protein for chromophore-assisted light inactivation (2013)
  • Author(s): Takemoto K, Matsuda T, Sakai N, Fu D, Noda M, Uchiyama S, Kotera I, Arai Y, Horiuchi M, Fukui K, Ayabe T, Inagaki F, Suzuki H, Nagai T.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 3 Pages: 2629-2629
  • NAID: 120006995014
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Analytical ultracentrifugation for quantitative intermolecular interaction studies (2014)
  • Author(s): 内山 進
  • Organizer: 第14回蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市
  • Year and Date: 2014-06-26
• [Presentation] 蛋白質の質量分析、ペプチドマッピングから複合体・高次構造解析まで (2013)
  • Author(s): 内山 進
  • Organizer: 第13回蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 鳥取
  • Invited
• [Presentation] Recent advancement of biophysical methods for protein-protein interactions (2013)
  • Author(s): Uchiyama S.
  • Organizer: 21th International AUC conference
  • Place of Presentation: Atami
  • Invited