CRISPRシステムにおけるエフェクター複合体の構造機能解析

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 25121744
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 沼田 倫征 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (10401564)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥9,620,000 (Direct Cost: ¥7,400,000、Indirect Cost: ¥2,220,000); Fiscal Year 2014: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2013: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
• Keywords: CRISPR-Cas / crRNA / Casタンパク質 / Cmr複合体 / Csm複合体 / エフェクター複合体 / ガイド鎖 / タグ配列 / CRISPR-Casシステム / RNAサイレンシング / 結晶構造解析 / リボ核タンパク質複合体

Outline of Annual Research Achievements

原核生物は獲得免疫機構CRISPR-Casシステムを利用してウイルスの感染から身を守っている。Cmr複合体は6種類のタンパク質（Cmr1～Cmr6）とcrRNAからなるエフェクター複合体で、ガイド配列と相補的なウイルスRNAを分解する。今年度は、Cmr複合体の作動原理を解明するために、その機能構造解析を行った。まず、Cmr複合体を再構成し、標的類似体との複合体の結晶構造を決定した。その結果、Cmr複合体にらせん状の溝が形成され、そこにcrRNAが配置されていることが分かった。標的類似体は、この溝に沿ってcrRNAのガイド配列に相補的に捕捉されていた。crRNAのガイド領域と標的類似体は2本鎖を形成していたが、核酸の一般的な2重らせん構造とは異なり、ほどけたリボン状であった。これは、Cmr4が持つ特徴的なループ領域が、6塩基対ごとに2本鎖の間に割って入り、塩基対の形成を周期的に阻害しているためである。Cmr複合体は3分子のCmr4を含むため、ガイド領域と標的の2本鎖は3カ所で塩基対の形成が阻害され、標的RNAの構造が大きく歪んで不安定化していた。生化学的な実験から、Cmr複合体は6 nt周期でこれら3カ所を切断することが分かった。crRNAの5’側に存在するタグ配列はCmr3に認識され、複合体中で固定化されていた。このため、Cmr複合体はcrRNAの5’側から数えて一定距離にある14番目、20番目、26番目の塩基対の形成を阻害し、標的RNAを6 nt周期で切断する。crRNAのタグ配列はヌクレオチドの配列に依存してCmr3によって認識されていたが、ガイド配列とCmrタンパク質との間の結合は、ガイド部分の配列に依存しないことが分かった。したがって、Cmr複合体は、任意のガイド配列をもったcrRNAと結合でき、さまざまな標的RNAを捕捉し分解することが明らかとなった。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structure of the Csm3-Csm4 subcomplex in the type III-A CRISPR-Cas interference complex (2015)
  • Author(s): T.Numata, H.Inanaga, C.Sato, and T.Osawa
  • Journal Title: J Mol Biol Volume: 427 Issue: 2 Pages: 259-273
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2014.09.029
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of the CRISPR-Cas RNA silencing Cmr complex bound to a target analog (2015)
  • Author(s): Takuo Osawa, Hideko Inanaga, Chikara Sato, and Tomoyuki Numata
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 58 Issue: 3 Pages: 418-430
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2015.03.018
  • NAID: 130005115744
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the CRISPR-Cas RNA silencing Cmr complex (2015)
  • Author(s): Takuo Osawa, Hideko Inanaga, and Tomoyuki Numata
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F Volume: - Issue: 6 Pages: 735-740
  • DOI: 10.1107/s2053230x15007104
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystal structure of the Cmr2-Cmr3 subcomplex in the CRISPR-Cas RNA silencing effector complex (2013)
  • Author(s): Osawa, T., Inanaga, H. and Numata, T.
  • Journal Title: J. Mol. Biol. Volume: 425 Issue: 20 Pages: 3811-3823
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2013.03.042
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the Cmr2-Cmr3 subcomplex in the CRISPR-Cas RNA-silencing effector complex (2013)
  • Author(s): Osawa, T., Inanaga, H. and Numata, T.
  • Journal Title: Acta Crystallogr. Sect. F Volume: 69 Issue: 5 Pages: 585-587
  • DOI: 10.1107/s1744309113011202
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 標的アナログと結合したCRISPR-Cas Cmr複合体の結晶構造 (2015)
  • Author(s): 沼田 倫征、大澤 拓生
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール（徳島）
  • Year and Date: 2015-06-24
• [Presentation] CRISPR-Casシステムのエフェクター複合体を構成するCmr2-Cmr3複合体の結晶構造
  • Author(s): 沼田倫征、大澤拓生
  • Organizer: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取市）
• [Remarks] プレス発表：細菌などの生体防御機構を解明
  • URL: http://www.aist.go.jp/aist_j/press_release/pr2015/pr20150424/pr20150424.html