エキソーム解析における難読領域を標的とする解読法の開発

• Project Area: Personal genome-based initiatives toward understanding bran diseases
• Project/Area Number: 25129706
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 工藤 純 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (80178003)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥10,400,000 (Direct Cost: ¥8,000,000、Indirect Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2014: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2013: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
• Keywords: エキソーム / ゲノム / 次世代シーケンサー / バイオテクノロジー / 遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではエキソーム解析における難読領域を対象として、その解読技術の開発を目指した。SureSelectを用いて得られたエキソーム解析の724kbからなる難読領域の多くはGC含量が高い(67.8%)配列であった。この難読領域を解読するためにHaloPlexターゲットエンリッチメントシステムによる難読領域の増幅と解読を試みた。約724kb/19,715カ所全体を標的としたところ約709kb(97.96%)の標的領域を計63,886個のAmplicon(シーケンス長計4.7Mb)として増幅するHaloPlexプローブライブラリーが作成できた。このライブラリーを用いて全ゲノムDNAから標的領域のDNAを増幅し、回収したDNA断片を次世代シーケンサーで平均カバレッジ256倍で解読したところ、709kbの標的領域のうち約83％について10倍以上の厚みで解読に成功した。これにより、エキソーム解析の大部分を解読することが可能になった。HaloPlex法でも解読できなかったGC含量が高い(78.4%)難読領域は、125kb/3500個所であった。難読領域長は長いものから100番目で178bp（合計24.2kb）、500番目で80bp（合計70.9kb）、1000番目で40bp（合計100kb）、1500番目で22bp（合計115.2kb）となり、当然のことながら、解析数を増やしても、その割には解読できる領域が長くなる訳ではなかった。長いものから順に、96組のPCRプライマーの設計を試みたところ、設計の成功率78％(96/123箇所)で、領域サイズは、421～167bp（合計21,518bp）となった。GC含量は、65/96で80％以上、89/96が70％以上と高かった。これら96組のプライマーを用いたPCRの結果、83/96(86%)で増幅が認められ、解読も可能であるものと思われる。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Mutations in SERPINB7, Encoding a Member of the Serine Protease Inhibitor Superfamily, Cause Nagashima-type Palmoplantar Keratosis (2013)
  • Author(s): Kubo A, Shiohama A, Sasaki T, Nakabayashi K, Kawasaki H, Atsugi T, Sato S, Shimizu A, Mikami S, Tanizaki H, Uchiyama M, Maeda T, Ito T, Sakabe J, Heike T, Okuyama T, Kosaki R, Kosaki K, Kudoh J, Hata K, Umezawa A, Tokura Y, Ishiko A, Niizeki H, Kabashima K, Mitsuhashi Y, Amagai M
  • Journal Title: Am J Hum Genet Volume: 93 Issue: 5 Pages: 945-956
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2013.09.015
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Mutations in SERPINB7, encoding a serine protease inhibitor, cause Nagashima-type palmoplantar keratosis (2014)
  • Author(s): Kubo, A. Shiohama, T. Sasaki, K. Nakabayashi, J. Kudoh, K. Hata, A. Umezawa, Y. Tokura, A. Ishiko, H. Niizeki, K. Kabashima, Y. Mitsuhashi, M. Amagai
  • Organizer: 2014 Society for Investigative Dermatology Annual Meeting
  • Place of Presentation: Albuquerque, New Mexico, USA
• [Presentation] 長島型掌蹠角化症の原因遺伝子SERPINB7の同定と患者30例の変異解析 (2014)
  • Author(s): 久保 亮治、塩濱 愛子、佐々木 貴史、中林 一彦、奥山 虎之、小崎 健次郎、工藤 純、秦 健一郎、梅澤 明弘、戸倉 新樹、石河 晃、新関 寛徳、椛島 健治、三橋 善比古、天谷 雅行
  • Organizer: 第113回日本皮膚科学会総会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館