Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
本課題では、本提案ではゲノム構造の変異を検出できる系を開発し、実用化することを目指す。方法としては以下の通りである。１．トランスポゾンとインテグラーゼを用いてバーコード配列ペアをゲノムDNAにランダムに挿入する。２．その後バーコードペアの内側を切断する。３．その結果、切断箇所を挟んで同一のバーコードが存在することになり、バーコードをたどることによって、となり同士であったフラグメントが分かるしくみの構築を目指した。これによってゲノム断片の再整列ができ、ゲノム全体の構造を解析することができる。各種トランスポゼースの大腸菌による発現精製を試みた。その結果、Tc1、Tn10, Tn7A, Tn7CおよびTn5について目的の分子量の位置に発現蛋白質を認めた。Tc1についてはHis-tagによる精製を、Tn10についてはHis-tagおよびintein-tagによる精製を試みた。Tc1は十分量の発現に成功したが、封入体を形成したため、培養コンディションや尿素による変性状態での精製とリフォールディングを試みたが発現蛋白質が不溶化するなど困難を極め、精製には至っていない。一方でTn10においてはintein-tagおよびHis-tagによる精製に成功した。そこで本酵素の活性を確認する目的で、Tn10トランスポゾン配列を含むDNA配列をTn10とともに反応させたところ、Tn10への結合活性を認めた。また、ゲノムDNAとTn10トランスポゾン配列を含むDNA配列とTN10を反応させ、300 bpの間隔でTn10が挿入したと認められる結果を得た。期間内ではバーコード付きのトランスポゾンをゲノムに挿入し断片化するまでには至らなかったが、引き続き本開発を継続させていきたいと考えている。
26年度が最終年度であるため、記入しない。
