複製フォーク再生メカニズムの解析

• Project Area: Coupling of replication, repair and transcription, and their common mechanism of chromatin remodeling
• Project/Area Number: 25131722
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 鐘巻 将人 国立遺伝学研究所, 新分野創造センター, 准教授 (20444507)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥11,960,000 (Direct Cost: ¥9,200,000、Indirect Cost: ¥2,760,000); Fiscal Year 2014: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2013: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
• Keywords: DNA複製 / 複製フォーク / 相同組換え / DNA修復 / ゲノム安定性 / タンパク質分解 / 植物ホルモン

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題はDNA複製フォークにおいて、人為的に複製フォークを構成する因子を分解除去することにより、複製フォークを破壊した際の果たして細胞は複製フォークを再生できるかどうか検証することを目的としている。この目的に対して、私が開発したオーキシンデグロン法と近年開発されたゲノム編集技術CRISPR-CASを利用する。
提案通り、ヒトHCT116細胞の内在性MCM2にデグロンタグを導入することに成功した。さらに、この株にオーキシンデグロン法に必要なF-box遺伝子も導入した。この細胞はオーキシン添加後、速やかにS期で細胞周期を停止した。またその際に、核内には多数のg-H2AXやRad51のダメージフォーカスが検出されたことから、実際に複製フォークが人為破壊されたことが確認された。また、フォーク再生に機能すると予想されるMCM8のフォーカスも検出された。
現在、フォーク人為破壊時にMCM2なしで起こるDNA合成を、ヌクレオチドアナログEdU取り込みを指標に検証している。またその取り込みがMCM8-9の有無に依存するかを検証中である。これら結果を得たのち、論文投稿を行う予定である。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] RecQ4 promotes the conversion of the pre-initiation complex at a site-specific origin for DNA unwinding in Xenopus egg extracts (2015)
  • Author(s): Sanuki, Kubota, Kanemaki MT, Takahashi TS, Mimura S, Takisawa H
  • Journal Title: Cell Cycle Volume: 14-7 Issue: 7 Pages: 1010-23
  • DOI: 10.1080/15384101.2015.1007003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rapid Depletion of Budding Yeast Proteins via the Fusion of an Auxin-Inducible Degron (AID) (2014)
  • Author(s): Nishimura K, Kanemaki MT
  • Journal Title: Current protocols in cell biology Volume: 64 Issue: 1
  • DOI: 10.1002/0471143030.cb2009s64
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Auxin-induced Rapid Degradation of Inhibitor of Caspase-activated DNase (ICAD) Induces Apoptotic DNA Fragmentation, Caspase Activation, and Cell Death: A CELL SUICIDE MODULE (2014)
  • Author(s): Samejima K, Ogawa H, Ageichik AV, Peterson KL, Kaufmann SH, Kanemaki MT, Earnshaw WC
  • Journal Title: The Journal of biological chemistry Volume: 289 Issue: 45 Pages: 31617-31623
  • DOI: 10.1074/jbc.m114.583542
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] MCM ヘリカーゼファミリー因子の構造と機能 (2014)
  • Author(s): 鐘巻将人
  • Journal Title: 生化学 Volume: 86 Pages: 249-254
  • NAID: 40020096213
• [Journal Article] Nuclear Pores Protect Genome Integrity by Assembling a Premitotic and Mad1-Dependent Anaphase Inhibitor (2014)
  • Author(s): Rodriguez-Bravo V, Maciejowski J, Corona J, Buch HK, Collin P, Kanemaki MT, Shah JV, Jallepalli PV.
  • Journal Title: Cell Volume: 156 Pages: 1017-1031
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The dimeric Mcm8-9 complex of Xenopus laevis likely has a conserved function for resistance to DNA damage (2013)
  • Author(s): Kanemaki MT.
  • Journal Title: Cell Cycle Volume: 12 Pages: 1338-1339
• [Presentation] ゲノム安定性に寄与する普段は見えないDNA合成 (2014)
  • Author(s): 鐘巻将人
  • Organizer: 日本分子生物学会WS 「細胞周期と通じた染色体恒常性制御機構のニューフロンティア」
  • Place of Presentation: 横浜（パシフィコ横浜会議センター）
  • Year and Date: 2014-11-27
  • Invited
• [Presentation] ゲノム安定性に寄与する普段は見えないDNA合成 (2014)
  • Author(s): 鐘巻将人
  • Organizer: 遺伝研研究集会「染色体DNA安定維持の分子メカニズム」
  • Place of Presentation: 三島（国立遺伝学研究所）
  • Year and Date: 2014-11-06
• [Presentation] A hidden DNA synthesis that contributes integrity of genomic DNA (2014)
  • Author(s): Masato Kanemaki
  • Organizer: US-Japan DNA repair meeting
  • Place of Presentation: 徳島 (グランドエクシブ鳴門）
  • Year and Date: 2014-10-29
• [Presentation] The Mcm8-9 complex promotes DNA synthesis after strand invasion in recombination repair
  • Author(s): Nishimura K., Natsume T., Kanemaki MT.
  • Organizer: Cold Spring Harbor Meeting on Eukaryotic DNA Replication and Genome Maintenance
  • Place of Presentation: CSH, New York, USA
• [Presentation] 植物ホルモンを利用した新たなタンパク質発現調節
  • Author(s): 鐘巻将人
  • Organizer: The ubiquitin code workshop in MBSJ, 2013
  • Place of Presentation: 神戸
  • Invited
• [Presentation] Mcm8-9複合体はRad51依存的ssDNA鎖もぐり込み反応後のDNA合成伸長反応を促進する
  • Author(s): 鐘巻将人
  • Organizer: 2013年度 国立遺伝学研究所研究会 「染色体ＤＮＡの安定維持の分子メカニズム」
  • Place of Presentation: 遺伝研、三島
• [Presentation] DNA二本鎖間架橋損傷修復におけるDNA複製と相同組換えの共役的役割
  • Author(s): 鐘巻将人
  • Organizer: 平成２５年度 新学術領域研究「がん研究分野の特性等を踏まえた支援活動」公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京
  • Invited
• [Presentation] A crossover between DNA replication and recombination in vertebrate cells
  • Author(s): Kanemaki MT.
  • Organizer: International Conference, Kyoto, 2014: DNA replication, repair and transcription; coupling mechanisms and chromatin dynamics for genome integrity
  • Place of Presentation: 京都
• [Book] 生化学：MCMヘリカーゼファミリー因子の構造と機能（ミニレビュー） (2014)
  • Author(s): 鐘巻将人
  • Publisher: 公益社団法人日本生化学学会
• [Remarks] 分子機能研究室HP
  • URL: http://www.nig.ac.jp/labs/MolFunc/Molecular_Function_HP/Home.html
• [Remarks] 遺伝研HP
  • URL: http://www.nig.ac.jp/section/kanemaki/kanemaki-j.html