一細胞シークエンシングによる、抗がん剤耐性獲得過程でのがん細胞進化の解明

• Project Area: Integrative Systems Understanding of Cancer for Advanced Diagnosis, Therapy and Prevention
• Project/Area Number: 25134721
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: National Cancer Center Japan
• Principal Investigator: 加藤 護 独立行政法人国立がん研究センター, 研究所, ユニット長 (40391916)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2014: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2013: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 一細胞シークエンス / 次世代シークエンサー / がんゲノム / バイオインフォマティクス / 抗がん剤耐性

Outline of Annual Research Achievements

前年度、HCC78 細胞株から抗がん剤Crizotinib 耐性の子株を得、子株６株に対しバルクセル･シークエンスと、3細胞のシングルセル･シークエンスを行った。そこでは、１）バルクセルとシングルセルではエラー率、マップ率などに大きな違いがないこと、２）しかしdepth の分布には大きな違いがあり、恐らく全ゲノム増幅の影響を反映していること、３）一細胞特異的な多くの変異があること、４）ある遺伝子変異が耐性を生じさせているであろう事、などが分かった。しかし同時に、実験および情報解析における課題も残った。シングルセル・シークエンスの過程では、手作業で限界希釈による細胞分離と、全ゲノム増幅を行った。しかしこの工程はlabor intensive であった。数十細胞以上を扱う場合、自動化された機器を用いることが好ましいことが分かり、本年度、自動細胞分離・調整装置であるC1 を用いて、この工程を行うことに成功した。C1 はもともとRNA トランスクリプトーム用に開発された機器だが、本年度夏にDNA エキソーム用のプロトコルが発表され、我々はいち早くこれを適用することが出来た。情報解析の課題は、変異検出の正確さである。このため、本年度では、純系マウスの正常腸管細胞から5細胞をシングルセル・シークエンスし、また同様に同じ組織からのバルクセルもシークエンスして、バルクをbackground、シングルをforeground としてシングルでの変異検出を行った。純系マウスの正常細胞かつ同じ組織からのバルクセルをbackground にしたコールであるため、ネガティブ・コントロールとなる。このデータを用いて変異検出のアルゴリズムを改良することが出来た。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Development of Lung Adenocarcinomas with Exclusie Dependence on Oncogene Fusions. (2015)
  • Author(s): Motonobu Saito, Yoko Shimada, Kouya Shiraishi, Hiromi Sakamoto, Koji Tsuta, Hirohiko Totsuka, Suenori Chiku, Hitoshi Ichikawa, Mamoru Kato, Shun-ichi Watanabe, Teruhiko Yoshida, Jun Yokota, Takashi Kohno
  • Journal Title: Cancer Research Volume: - Issue: 11 Pages: 2264-2271
  • DOI: 10.1158/0008-5472.can-14-3282
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Profiling of actionable gene alterations in ovarian cancer by targeted deep sequencing. (2015)
  • Author(s): Masataka Takenaka, Motonobu Saito, Reika Iwakawa, Nozomu Yanaihara, Misato Saito, Mamoru Kato, Hitoshi Ichikawa, Tatsuhiro Shibata, Jun Yokota, Aikou Okamoto, Takashi Kohno
  • Journal Title: International Journal of Oncology Volume: 46 Issue: 6 Pages: 2389-2398
  • DOI: 10.3892/ijo.2015.2951
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comprehensive DNA adduct analysis reveals pulmonary inflammatory response contributes to genotoxic action of magnetite nanoparticles (2015)
  • Author(s): Kousuke Ishino, Tatsuya Kato, Mamoru Kato, Tatsuhiro Shibata, Masatoshi Watanabe, Keiji Wakabayashi, Hitoshi Nakagama, Yukari Totsuka
  • Journal Title: Int. J. Mol. Sci. Volume: 16 Pages: 3474-3492
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Trans-ancestry mutational landscape of hepatocellular carcinoma genomes. (2014)
  • Author(s): Yasushi Totoki, Kenji Tatsuno, Kyle R Covington, Hiroki Ueda, Chad J Creighton, Mamoru Kato, Shingo Tsuji,Lawrence A Donehower, Betty L Slagle, Hiromi Nakamura, Shogo Yamamoto, Eve Shinbrot, Natsuko Hama, Megan Lehmkuhl, Fumie Hosoda, Yasuhito Arai, Kim Walker, ・・・・Hiroyuki Aburatani & Tatsuhiro Shibata
  • Journal Title: Nature Genetics Volume: 46 Pages: 1267-1273
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular mechanisms underlying oncogenic RET fusion in lung adenocarcinoma. (2014)
  • Author(s): Tatsuji Mizukami, Kouya Shiraishi, Yoko Shimada, Hideaki Ogiwara, Koji Tsuta, Hitoshi Ichikawa, Hiromi Sakamoto, Mamoru Kato, Tatsuhiro Shibata, Takashi Nakano, Takashi Kohno
  • Journal Title: Journal of Thoracic Oncology Volume: 9 Pages: 622-630
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mutually exclusive mutations of KIT and RAS are associated with KIT mRNA expression and chromosomal instability in primary intracranial pure germinomas (2014)
  • Author(s): Shintaro Fukushima, Ayaka Otsuka, Tomonari Suzuki, Takaaki Yanagisawa, Kazuhiko Mishima, Akitake Mukasa, Nobuhito Saito, Toshihiro Kumabe,・・・・ Mamoru Kato, Tatsuhiro Shibata,・・・・Koichi Ichimura,On behalf of the Intracranial Germ Cell Tumor Genome Analysis Consortium (iGCT Consortium)
  • Journal Title: Acta Neuropathologica Volume: 127 Pages: 911-925
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NCYM, a de novo evolved protein, stabilizes MYCN and characterizes human neuroblastoma. (2014)
  • Author(s): Yusuke Suenaga, S. M. Rafiqul Islam, Jennifer Alagu, Yoshiki Kaneko, Mamoru Kato, Yukichi Tanaka, Hidetada Kawana, Shamim Hossain, Daisuke Matsumoto, Mami Yamamoto, Wataru Shoji, Makiko Itami, Tatsuhiro Shibata, Yohko Nakamura, Miki Ohira, Seiki Haraguchi, Atsushi Takatori, Akira Nakagawara.
  • Journal Title: PLoS Genetics Volume: 10
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 一細胞ゲノム解析 (2014)
  • Author(s): 加藤護
  • Journal Title: 医学の歩み Volume: 249 Pages: 1088-1092
• [Journal Article] 発がんドライバー変異の同定 (2014)
  • Author(s): David Tamborero, Abel Gonzalez-Perez, and Nuria Lopez-Bigas; 加藤護（訳）
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 32 Pages: 213-219
• [Presentation] Cancer-cell evolution revealed by observations at different time points (2013)
  • Author(s): Mamoru Kato
  • Organizer: 72nd Annual Meeting of the Japanese Cancer Association
  • Place of Presentation: Yokohama
• [Presentation] Case report on wet-dry fusion by a dry researcher who aims at wet research goals (2013)
  • Author(s): Mamoru Kato
  • Organizer: The 36th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan
  • Place of Presentation: Kobe
• [Book] 一細胞ゲノム解析 (2014)
  • Author(s): 加藤 護
  • Total Pages: 5
  • Publisher: 医学の歩み
• [Remarks] 一細胞シークエンシングによる、抗がん剤耐性獲得過程でのがん細胞進化の解明
  • URL: http://cancersystem.hgc.jp/_media/%E3%82%B7%E3%82%B9%E3%83%86%E3%83%A0%E3%81%8C%E3%82%93%E3%83%8B%E3%83%A5%E3%83%BC%E3%82%B9%E3%83%AC%E3%82%BF%E3%83%BCno8.pdf