ＡＴＰ駆動サイボーグ回転分子モーターの創生

• Project Area: Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions
• Project/Area Number: 26102507
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences
• Principal Investigator: 飯野 亮太 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 教授 (70403003)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000); Fiscal Year 2015: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2014: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: 分子モーター / タンパク質工学 / １分子計測

Outline of Annual Research Achievements

回転分子モーターF1-ATPaseにおけるATP加水分解反応の触媒に重要な役割を果たすαサブユニット上のアミノ酸残基、アルギニンフィンガーの役割を調べるため、アルギニン残基を非天然アミノ酸である2,7-diaminoheptanoic acid（Lyk）に置換した非天然型F1-ATPaseを創生した。具体的には、アンバーコドンを利用して非天然アミノ酸を導入したαサブユニットを無細胞タンパク質発現系で合成し、β、γサブユニットを発現させた大腸菌の破砕液と混合することで再構成させる手法を確立した。
さらに、創生した非天然型F1-ATPaseの１分子回転観察で機能解析を行った。ATP存在下で、非天然型F1-ATPaseは野生型と同様、回転子から見て反時計回りの回転運動を示した。しかしながら、最高回転速度は0.2rpsと野生型の1/500程度に大きく低下しており、高濃度[ATP]においても120度間隔の3か所の停止が観察された。また、ATPの結合速度定数は6.5x10E6 M-1s-1と野生型の1/3程度であった。低濃度[ATP]と高濃度[ATP]の溶液交換実験の結果、長くなっているのは40度サブステップ前の停止であることが明らかとなった。また、ATPγSを基質に用いた１分子回転実験では停止の長さが30倍長くなった。さらに、溶液中に過剰の無機リン酸を加えた際の回転運動への影響は野生型と変わらなかった。これらの結果から、非天然型F1-ATPaseは野生型に比べ、ATPのリン酸結合の開裂が非常に遅くなっていることが明らかとなった。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] A microfluidic channel method for rapid drug-susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa (2016)
  • Author(s): Matsumoto Y, Sakakihara S, Grushnikov A, Kikuchi K, Noji H, Yamaguchi A, Iino R, Yagi Y, Nishino K
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 11 Issue: 2 Pages: 1-17
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0148797
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Single-cell detection and collection of persister bacteria in a directly accessible femtoliter droplet array (2016)
  • Author(s): Iino R, Sakakihara S, Matsumoto Y, Nishino K
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 1333 Pages: 101-109
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-2854-5_9
  • ISBN: 9781493928538, 9781493928545
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Key Chemical Factors of Arginine Finger Catalysis of F1-ATPase Clarified by an Unnatural Amino Acid Mutation (2014)
  • Author(s): Yukawa A, Iino R, Watanabe R, Hayashi S and Noji H
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 54 Issue: 2 Pages: 472-480
  • DOI: 10.1021/bi501138b
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Direct observation of intermediate states during the stepping motion of kinesin-1 (2016)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: 8th Japan-Korea Seminars on Biomolecular Science: Experiments and Simulation
  • Place of Presentation: 愛知県岡崎市（岡崎コンファレンスセンター）
  • Year and Date: 2016-02-15
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Single-molecule analysis of new molecular motors hydrolyzing crystalline polysaccharides (2016)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: PACCON2016
  • Place of Presentation: Bangkok, Thailand (BITEC)
  • Year and Date: 2016-02-10
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Single-molecule high-speed imaging analysis of ATP-driven molecular motors (2015)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: 第53回生物物理学会年会シンポジウム「Formation of spatiotemporal dynamic ordering mediated by ATP hydrolysis」
  • Place of Presentation: 石川県金沢市（金沢大学）
  • Year and Date: 2015-09-14
  • Invited
• [Presentation] 生体分子モーターを測る、壊す、創る (2014)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: シンポジウム「細胞のメゾスケール構造機能」
  • Place of Presentation: 京都府京都市（京都大学）
  • Year and Date: 2014-12-13
  • Invited
• [Presentation] Single-molecule imaging analysis of molecular motors (2014)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: The 7th Korea-Japan Seminars on Biomolecular Sciences
  • Place of Presentation: Seoul, Korea (KAIST)
  • Year and Date: 2014-11-27
  • Invited
• [Presentation] 生体分子モーターダイナミクスの１分子計測：構造解析と理論予測との協奏を目指して (2014)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: TCCI第5回研究会
  • Place of Presentation: 愛知県岡崎市（岡崎コンファレンスセンター）
  • Year and Date: 2014-10-17
  • Invited
• [Presentation] DNAを巻き取る分子リール (2014)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 第66回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 奈良県奈良市（奈良県新公会堂）
  • Year and Date: 2014-06-12
  • Invited
• [Remarks] 自然科学研究機構 岡崎統合バイオサイエンスセンター 飯野グループホームページ
  • URL: https://groups.ims.ac.jp/organization/iino_g/index.html