sHspの動的秩序制御による機能発現の分子機構解明

• Project Area: Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions
• Project/Area Number: 26102511
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 養王田 正文 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (50250105)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000); Fiscal Year 2015: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2014: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: シャペロン / ヒートショックプロテイン / CHO細胞 / リン酸化 / 構造変化 / 生物物理 / 生体分子 / スモールヒートショックプロテイン

Outline of Annual Research Achievements

Chinese Hamster Ovary(CHO)細胞由来sHspを用いて研究を進めた。CHO細胞由来Hsp27(HspB1)の配列において他のHsp27においてリン酸化が確認されているS15をアスパラギン酸に置換したリン酸化模倣体S15Dを構築した。S15DはWild Typeと比較して低温で、クエン酸合成酵素の凝集を抑制し、オリゴマーの解離が確認された。この結果から、動物細胞ではリン酸化のよりsHspのシャペロンとしての機能が活性化されることが明らかになった。また、解離する温度条件でのHPLCにおいてsHspのピークが消失するという問題があったが、エチレングリコールをバッファーに加えることによりピークが確認された。この結果は、Hsp27はオリゴマーが解離することにより疎水表面が露出し、カラムの担体と疎水相互作用することでピークが消失したことを示している。また、Hsp27の結晶化も試みたが、構造解析可能な結晶を得ることはできていない。in vivoでのリン酸化部位の特定を試みたが、これも成功していない。一方、これまでに報告されたsHspの多くは、非ストレス条件下でC末端領域のI-X-Iモチーフによりダイマー同士が結合し、高次オリゴマーを形成している。哺乳類に存在する10種類のsHsp（HspB1－HspB10）の内、HspB8とHspB9はI-X-Iモチーフを持たないことから、高次オリゴマーを形成せず一般的なsHspとは異なるシステムで機能していると考えられている。そこでCHO細胞由来HspB8とHspB9を大腸菌で発現・精製し、その機能・構造解析を行った。ゲル濾過HPLCを用いてHspB8及びHspB9の分子量を測定した。その結果、どちらも高次オリゴマーは形成せず、ダイマーで存在していることが確認できた。さらに、蛋白質凝集抑制活性において、基質特異性があることを示す結果が得られた。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Contribution of the C-Terminal Region of a Group II Chaperonin to its Interaction with Prefoldin and Substrate Transfer. (2016)
  • Author(s): Zako T, Sahlan M, Fujii S, Yamamoto YY, Tai PT, Sakai K, Maeda M, Yohda M.
  • Journal Title: J Mol Biol. Volume: 印刷中 Issue: 11 Pages: 2405-2417
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2016.04.006
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Thermosome: A Group II Chaperonin of Archaea. (2016)
  • Author(s): Yamamoto Y, Yohda M.
  • Journal Title: eLS. John Wiley & Sons Ltd, Chichester. Volume: 該当なし Pages: 1-7
  • DOI: 10.1002/9780470015902.a0026332
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structures of halohydrin hydrogen-halide-lyases from Corynebacterium sp. N-1074. (2015)
  • Author(s): Watanabe F, Yu F, Ohtaki A, Yamanaka Y, Noguchi K, Yohda M, Odaka M.
  • Journal Title: Proteins. Volume: 83 Issue: 12 Pages: 2230-2239
  • DOI: 10.1002/prot.24938
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NADH oxidase and alkyl hydroperoxide reductase subunit C (peroxiredoxin) from Amphibacillus xylanus form an oligomeric assembly (2015)
  • Author(s): Toshiaki Arai, Shinya Kimata, Daichi Mochizuki, Keita Hara, Tamotsu Zako, Masafumi Odaka, Masafumi Yohda, Fumio Arisaka, Shuji Kanamaru, Takashi Matsumoto, Shunsuke Yajima, Junichi Sato, Shinji Kawasaki, Youichi Niimura
  • Journal Title: FEBS Open Bio Volume: 5 Issue: 1 Pages: 124-131
  • DOI: 10.1016/j.fob.2015.01.005
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Time-resolved crystal structures of the reaction intermediate of nitrile hydrase reveal a role for the cystein-sulfenic acid ligand as a catalyst nucleophile (2015)
  • Author(s): Yasuaki Yamanaka, Yuki Kato, Koichi Hashimoto, Keisuke Iida, Kazuo Nagasawa, Hiroshi Nakayama, Naoshi Dohmae, Keiichi Noguchi, Takumi Noguchi, Masafumi Yohda, and Masafumi Odaka
  • Journal Title: Angew. Chem., Int. Ed. Volume: 54 Issue: 37 Pages: 10763-10767
  • DOI: 10.1002/anie.201502731
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Packaging guest proteins into the encapsulin nanocompartment from Rhodococcus erythropolis N771 (2015)
  • Author(s): Tamura A, Fukutani Y, Takami T, Fujii M, Nakaguchi Y, Murakami Y, Noguchi K, Yohda M, Odaka M.
  • Journal Title: Biotechnol Bioeng Volume: 112 Issue: 1 Pages: 13-20
  • DOI: 10.1002/bit.25322
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Goniothalamin enhances the ATPase activity of the molecular chaperone Hsp90 but inhibits its chaperone activity. (2015)
  • Author(s): Yuhei Yokoyama, Aguru Ohtaki, Ibrahim Jantan, Masafumi Yohda, Hitoshi Nakamoto
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 157 Issue: 3 Pages: 161-168
  • DOI: 10.1093/jb/mvu061
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] CHO細胞由来Small Heat Shock Proteinの動的制御機構解析 (2015)
  • Author(s): 謝英良、山本陽平、岡俊彦、野口恵一、養王田正文
  • Organizer: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-02
• [Presentation] 好熱性真菌 Chaetomium thermophilum 由来Hsp104の機能構造解析 (2015)
  • Author(s): 北亮一、井上耀介、山本陽平、野口恵一、篠原恭介、尾高雅文、養王田正文
  • Organizer: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-02
• [Presentation] 細胞質プロテオスタシス制御を担うグループII型シャペロニンの構造と機能 (2015)
  • Author(s): 養王田正文、山本陽平、阿部圭佑、宇野裕子、関口博史、小川直樹、佐々木裕次
  • Organizer: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] グループII型シャペロニンCCTにおけるサブユニット協調作用の解析 (2015)
  • Author(s): 山本陽平、謝英良、宇野裕子、池上健太郎、堂前直、養王田正文
  • Organizer: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] STRUCTURAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF HSP27 FROM CHO CELL (2015)
  • Author(s): Masafumi Yohda、Eiryo Sha、Yohei Y.Yamamoto、Toshihiko Oka、Keiichi Noguchi
  • Organizer: The 4th International Symposium on Dynamical Ordering of Biomolecular System for Creation of Integrated Functions
  • Place of Presentation: 九州大学西新プラザ（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2015-11-23
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Protein folding mechanism of group II chaperonin (2015)
  • Author(s): Masafumi Yohda、Yohei Yamamoto、Ayumi Nakagawa、Hiroshi Sekiguchi、Toshihiko Oka、Junihiro Kuwajima、Yuji C.Sasaki
  • Organizer: 第10回 臨床ストレス応答学会
  • Place of Presentation: 東京農工大学小金井キャンパス（東京都小金井市）
  • Year and Date: 2015-11-07
• [Presentation] 好熱性真菌 Caetomium thermophilum由来 Hsp104の構造解析 (2015)
  • Author(s): 北亮一、井上耀介、山本陽平、野口恵一、篠原恭介、尾高雅文、養王田正文
  • Organizer: 第10回 臨床ストレス応答学会
  • Place of Presentation: 東京農工大学小金井キャンパス（東京都小金井市）
  • Year and Date: 2015-11-06
• [Presentation] CHO細胞由来 Small Heat Shock Protein の動的制御機構解析 (2015)
  • Author(s): 謝英良、山本陽平、岡俊彦、野口恵一、養王田正文
  • Organizer: 第10回 臨床ストレス応答学会
  • Place of Presentation: 東京農工大学小金井キャンパス（東京都小金井市）
  • Year and Date: 2015-11-06
• [Presentation] グループII型シャペロニンCCTにおけるサブユニット協調作用の解析 (2015)
  • Author(s): 山本陽平、謝英良、宇野裕子、池上健太郎、堂前直、養王田正文
  • Organizer: 第10回 臨床ストレス応答学会
  • Place of Presentation: 東京農工大学小金井キャンパス（東京都小金井市）
  • Year and Date: 2015-11-06
• [Presentation] Methanococcus maripaludis 由来II型シャペロニンの動的解析 (2015)
  • Author(s): 阿部圭佑、山本陽平、Judith Frydman、養王田正文、関口博史、佐々木裕次、小川直樹
  • Organizer: 第15回 日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 徳島県あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-25
• [Presentation] 好熱性真菌Chaetomium thermophilum由来Hsp104, Hsp70及び Hsp40シャペロンシステムの機能・構造解析 (2015)
  • Author(s): 井上耀介、北亮一、山本陽平、野口恵一、尾高雅文、養王田正文
  • Organizer: 第15回 日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 徳島県あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-25
• [Presentation] 好熱性真菌Chaetomium thermophilum由来CCTの発現系構築及び機能解析 (2015)
  • Author(s): 山本陽平、謝英良、池上健太郎、堂前直、養王田正文
  • Organizer: 第15回 日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 徳島県あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-24
• [Presentation] Inter-Ring Communication Is Dispensable in the Reaction Cyale of Gtoup II Chaperonins (2015)
  • Author(s): Yohei Yamamoto、Yuki Abe、Kazuki Moriya、Mayuno Arita、Keiichi Noguchi、Noriyuki Ishii、Hiroshi Sekiguchi、Yuji Sasaki、Masafumi Yohda
  • Organizer: EMBO Conference Series：The Biology of Molecular Chaperones
  • Place of Presentation: Heraklion, Greece
  • Year and Date: 2015-05-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structure and molecular characterization of sHsps from Schizosaccaromyces pombe and Cricetulus griseus (2015)
  • Author(s): Masafumi Yohda、Yuya Hanazono、Kazuki Takeda、Toshihiko Oka、Eiryo Sha、Yohei Yamamoto、Kunio Miki
  • Organizer: EMBO Conference Series：The Biology of Molecular Chaperones
  • Place of Presentation: Heraklion, Greece
  • Year and Date: 2015-05-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 好熱性真菌Chaetomium thermophilum 由来Hsp104の機能構造解析 (2014)
  • Author(s): 北 亮一、山本 陽平、野口 恵一、尾高 雅文、養王田 雅文
  • Organizer: 第66回 日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター、札幌
  • Year and Date: 2014-09-11
• [Presentation] 好熱性真菌Chaetomium thermophilum由来Hsp104の機能構造解析 (2014)
  • Author(s): 北 亮一、山本 陽平、謝 英良、 池上 健太郎、野口 恵一、尾高 雅文、 養王田 正文
  • Organizer: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ワークピア横浜・横浜産貿ホール、横浜
  • Year and Date: 2014-06-25
• [Presentation] Rhodococcus erythropolis N771 由来Encapsulin を用いた機能性ナノ粒子開発に関する研究 (2014)
  • Author(s): 養王田 正文、田村 彰朗、福谷 洋介、野口 恵一、尾高 雅文
  • Organizer: 平成26年度日本生化学会関東支部例会
  • Place of Presentation: 茨城大学、水戸
  • Year and Date: 2014-06-14
• [Presentation] タンパク質ナノ構造体Encapslinの特性とゲストタンパク質封入法の開発 (2014)
  • Author(s): 尾高 雅文、田村 彰朗、福谷 洋介、藤井 基子、高見 拓、村上 義彦、野口 恵一、養王田 正文
  • Organizer: 第41回生体分子科学討論会2014
  • Place of Presentation: 九州大学、福岡
  • Year and Date: 2014-06-06