リポソーム内膜タンパク質合成系を用いた細胞膜動態の再構成

• Project Area: Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions
• Project/Area Number: 26102528
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 松浦 友亮 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50362653)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2015: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2014: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
• Keywords: 膜タンパク質 / ダイナミクス / 合成生物学 / リポソーム / 無細胞翻訳系 / 構成的アプローチ

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、無細胞翻訳系を用いて細胞サイズ（1-5 マイクロメートル）のリポソーム内外でヒトのミトコンドリア由来膜タンパク質Letm1を合成し、Letm1の機能発現のダイナミクスを調べることを目的とした。
これまでにリポソーム内部でLetm1を合成した際、C末端に蛍光タンパク質mCherryを融合させた遺伝子を用いることで、Letm1の膜への局在を確認した。加えて、リポソームサイズの変化がリポソームの脂質組成に依存することもわかった。
Letm1はプロトンと共役してCa2+イオンを輸送するカルシウムチャネルである。そこで、Ca2+イオンの輸送活性を検出する実験系を構築し、リポソームの脂質組成とCa2+輸送活性の関係性を明らかにした。Ca2+イオンを検出するためには、複数の蛍光インジケータを検討し、Fluo4を用いた場合に最も強いシグナルが観測されたためこれを選択した。次に、ミトコンドリア内膜を構成する主要な4種類の脂質、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、カルジオリピン(CL)、ホスファチジルイノトール(PI)を混ぜて作製したリポソーム内でLetm1を合成した。その結果、Letm1のリポソーム膜へ局在及びCa2+の輸送活性が確認された。このように活性型のLetm1を合成可能な実験条件を明らかにした。次に、Letm1が機能を発現するメカニズムの詳細を明らかにするために、Ca2+の輸送活性の脂質依存性を調べた。その結果、PC, PE, CL, PIの全てが存在するときにのみ活性が見られた。この結果は、Letm1の機能発現するためには脂質分子が重要な役割を果たしており、またこれらの脂質が協同的に働いていることを示している。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Liposome-based in vitro evolution of aminoacyl-tRNA synthetase for enhanced pyrrolysine derivative incorporation. (2015)
  • Author(s): Uyeda A, Watanabe T, Kato Y, Watanabe H, Yomo T, Hohsaka T, Matsuura T
  • Journal Title: Chembiochem Volume: 16 Issue: 12 Pages: 1797-1802
  • DOI: 10.1002/cbic.201500174
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] <i>In vitro</i> directed evolution of alpha-hemolysin by liposome display (2015)
  • Author(s): Fujii, S., Matsuura, T., and Yomo, T.
  • Journal Title: BIOPHYSICS Volume: 11 Issue: 0 Pages: 67-72
  • DOI: 10.2142/biophysics.11.67
  • NAID: 130004940815
  • ISSN: 1349-2942
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] MembranCurvature Affects the Formation of alpha-Hemolysin Nanopores (2015)
  • Author(s): Fujii, S., Matsuura, T., and Yomo, T.
  • Journal Title: ACS Chem Biol. Volume: 未定 Issue: 7 Pages: 1694-701
  • DOI: 10.1021/acschembio.5b00107
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The evolutionary enhancement of genotype-phenotype linkages in the presence of multiple copies of genetic material (2014)
  • Author(s): Uno, K., Sunami, T., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Matsuura, T., and Yomo, T.
  • Journal Title: Chembiochem Volume: 15 Issue: 15 Pages: 2291-2288
  • DOI: 10.1002/cbic.201402299
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of giant unilamellar vesicles with permeability to small charged molecules (2014)
  • Author(s): Nishimura, K., Matsuura, T., Sunami, T., Fujii, S., Nishimura, K., Suzuki, H., and Yomo, T.
  • Journal Title: Rsc Adv Volume: 4(66) Issue: 66 Pages: 35224-35232
  • DOI: 10.1039/c4ra05332j
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] In Vitro Membrane Protein Synthesis Inside Cell-Sized Vesicles Reveals the Dependence of Membrane Protein Integration on Vesicle Volume. (2013)
  • Author(s): Soga, H., Fujii, S., Yomo, T., Kato, Y., Watanabe, H. and Matsuura, T.
  • Journal Title: ACS synthetic biology Volume: 0 Issue: 6 Pages: 372-379
  • DOI: 10.1021/sb400094c
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cell-free Protein Synthesis in a Microchamber Revealed the Presence of an Optimum Compartment Volume for High-order Reactions (2013)
  • Author(s): T. Okano, T. Matsuura, H. Suzuki, and T. Yomo
  • Journal Title: ACS Synthetic Biology Volume: 3 Issue: 6 Pages: 347-352
  • DOI: 10.1021/sb400087e
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Dynamics of biological systems constructed in vitro (2015)
  • Author(s): Tomoaki Matsuura
  • Organizer: 新学術領域研究「動的機能と秩序」第４回国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 九州大学西新プラザ・福岡市
  • Year and Date: 2015-11-22
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] in vitroで生体分子を使って組み上げる生命システム. (2014)
  • Author(s): 松浦友亮
  • Organizer: 国際高等研研究プロジェクト「分子基盤に基づく生体機能ネットワークとダイナミクスの解明」第1回研究会プログラム
  • Place of Presentation: 国際高等研研究（木津川市）
  • Year and Date: 2014-12-14 – 2014-12-15
  • Invited
• [Presentation] IN VITRO EVOLUTION OF alpha-HEMOLYSIN USING A LIPOSOME DISPLAY (2014)
  • Author(s): Tomoaki Matsuura
  • Organizer: Protein Society Meeting
  • Place of Presentation: SanDiego, U. S. A.
  • Year and Date: 2014-07-27 – 2014-07-30
  • Invited
• [Presentation] Engineering Membrane Proteins Entirely in vitro with Liposome Display Technology (2014)
  • Author(s): Tomoaki Matsuura
  • Organizer: KSBB SPRING MEETING and INTERNATIONAL SYMPOSIUM
  • Place of Presentation: Hyundai Hotel, Gyeongju, Korea
  • Year and Date: 2014-04-10
  • Invited