柔らかなタンパク質反応場を利用した立体選択的金属酵素の論理的開発

• Project Area: Science on Function of Soft Molecular Systems by Cooperation of Theory and Experiment
• Project/Area Number: 26104523
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 大洞 光司 大阪大学, 工学研究科, 助教 (10631202)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000); Fiscal Year 2015: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2014: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: 酵素 / 蛋白質 / 分子動力学計算 / ヘム / 立体選択性

Outline of Annual Research Achievements

本年度は当該研究の最終年度であるので、前年度に作成した人工金属酵素の触媒活性の評価において得られた結果をフィードバックし、より高機能な人工金属酵素を設計し、実際にその調製および評価を実施した。反応場にはヘムタンパク質であるミオグロビンを用いて、ヘムタンパク質補因子置換法(再構成法)に基づき、ヘムを除去したアポタンパク質に人工補因子であるマンガンポルフィセンを挿入したものを基盤にして進めた。特にタンパク質側の変異による高機能化を狙い、分子動力学計算を利用した変異体設計と遺伝子工学的手法による変異導入を実施した。効率的なサンプルの調製を意識して、ストレップタグII付きのミオグロビン変異体を発現し、ストレプトタクチンカラムにより精製した。ヘムのマンガンポスフィセンの置換により得られた人工金属酵素については吸収スペクトルや質量分析を行い、同定した。過酸化水素駆動によるエチルベンゼンを基質とした水酸化触媒活性（触媒回転数）をガスクロマトグラフィー法（GC）により定量し、キラルカラムを用いて生成物の立体選択性を評価した。変異を導入する前は14%であった立体選択性が大幅に向上し、分子動力学計算を用いた設計の有用性が明らかになった。興味深いことに、実施した20のサンプルに対して計算と実験結果の相関を確かめるため、横軸に予測値、縦軸に実験値をプロットしたところ、良い相関が観測され、本手法による人工金属酵素の論理的な設計の可能性が確認された。さらに本設計手法は立体選択性だけでなく、触媒活性や位置選択性の向上にも応用できると期待される。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Intraprotein transmethylation via a CH3–Co(III) species in myoglobin reconstituted with a cobalt corrinoid complex (2016)
  • Author(s): Y. Morita, K. Oohora, A. Sawada, K. Doitomi, J. Ohbayashi, T. Kamachi, K. Yoshizawa, Y. Hisaeda, T. Hayashi
  • Journal Title: Dalton Transactions Volume: 45 Issue: 8 Pages: 3277-3284
  • DOI: 10.1039/c5dt04109k
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Crystal Structures and Coordination Behavior of Aqua- and Cyano-Co(III) Tetradehydrocorrins in the Heme Pocket of Myoglobin (2016)
  • Author(s): Y. Morita, K. Oohora, E. Mizohata, A. Sawada, T. Kamachi, K. Yoshizawa, T. Inoue, T. Hayashi
  • Journal Title: Inorganic Chemistry Volume: 55 Issue: 3 Pages: 1287-1295
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.5b02598
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Oxygen-binding Protein Fiber and Microgel: Supramolecular Myoglobin–Poly(acrylate) Conjugates (2016)
  • Author(s): T. Ono, Y. Hisaoka, A. Onoda, K. Oohora, T. Hayashi
  • Journal Title: Chem. Asian J. Volume: 41 Issue: 7 Pages: 1036-1042
  • DOI: 10.1002/asia.201501415
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Energy migration within hexameric hemoprotein reconstituted with Zn porphyrinoid molecules (2015)
  • Author(s): Takashi Hayashi
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 51 Issue: 55 Pages: 11138-11140
  • DOI: 10.1039/c5cc02680f
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Meso-dibenzoporphycene has a Large Bathochromic Shift and a Porphycene Framework with an Anomalous Cis Tautomeric Form (2015)
  • Author(s): Koji Oohora, Ayumu Ogawa, Tamaki Fukuda, Akira Onoda, Jun-ya Hasegawa, Takashi Hayashi
  • Journal Title: Angew. Chem., Int. Ed. Volume: 印刷中 Issue: 21 Pages: 6227-6230
  • DOI: 10.1002/anie.201501496
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Co(II)/Co(I) Reduction-induced Axial Histidine-flipping in Myoglobin Reconstituted with a Cobalt Tetradehydrocorrin as a Methionine Synthase Model (2014)
  • Author(s): Takashi Hayashi, Yoshitsugu Morita, Eiichi Mizohata, Koji Oohora, Jun Ohbayashi, Tsuyoshi Inoue, and Yoshio Hisaeda
  • Journal Title: Chem. Commun. Volume: 50 Issue: 83 Pages: 12560-12563
  • DOI: 10.1039/c4cc05448b
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Hemoprotein-based Supramolecular Assembling Systems (2014)
  • Author(s): Koji Oohora, Takashi Hayashi
  • Journal Title: Curr. Opin. Chem. Biol. Volume: 19 Pages: 154-161
  • DOI: 10.1016/j.cbpa.2014.02.014
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Dibenzoporphycene with Annulated Benzene Rings at Two Ethylene Bridges of the Porphycene Framework (2016)
  • Author(s): Koji Oohora,
  • Organizer: ICPP9
  • Place of Presentation: 南京、中国
  • Year and Date: 2016-07-03
  • Invited
• [Presentation] H2O2-dependent hydroxylation of C-H bond by myoglobin reconstituted with a manganese porphycene complex (2015)
  • Author(s): Koji Oohora
  • Organizer: Pacifichem2015
  • Place of Presentation: ホノルル、ハワイ
  • Year and Date: 2015-12-15
  • Invited
• [Presentation] 立体選択的な水酸化酵素をめざしたマンガンポルフィセン錯体を含むミオグロビンの設計と構築 (2015)
  • Author(s): 大洞 光司
  • Organizer: 第５３回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-13
• [Presentation] ヘムタンパク質を基盤とした超分子集合体および人工酵素の調製 (2015)
  • Author(s): 大洞 光司
  • Organizer: 第２８回生物無機化学夏季セミナー
  • Place of Presentation: 山喜旅館（静岡県伊東市）
  • Year and Date: 2015-08-28
  • Invited
• [Presentation] Catalytic Hydroxylation of C-H Bond by Mn Porphycene-containing Myoglobin (2015)
  • Author(s): Koji Oohora, Takako Nishiura, Hiroyuki Meichin, Takashi Hayashi
  • Organizer: Metals in Biology
  • Place of Presentation: 理化学研究所（埼玉県和光市）
  • Year and Date: 2015-06-16
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 亜鉛置換型ヘムタンパク質環状六量体の光化学的性質 (2015)
  • Author(s): 大洞 光司、真島 剛史、平山 翔太、林 高史
  • Organizer: 第13回 ホスト・ゲスト化学シンポジウム
  • Place of Presentation: 東北大学（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2015-06-06
• [Presentation] Artificial light harvesting system constructed by reconstitution of a hexameric hemoprotein with Zn porphyrinoids (2015)
  • Author(s): Koji Oohora, Tsuyoshi Mashima, Takashi Hayashi
  • Organizer: 5th Georgian Bay International Conference on Bioinorganic Chemistry
  • Place of Presentation: オンタリオ、カナダ
  • Year and Date: 2015-05-20
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ポルフィセンマンガン錯体を挿入したミオグロビンの触媒的水酸化反応における活性中心近傍の変異と立体選択性 (2015)
  • Author(s): 西浦貴子・大洞光司・林高史
  • Organizer: 日本化学会第95春季年会
  • Place of Presentation: 日本大学船橋キャンパス（千葉県船橋市）
  • Year and Date: 2015-03-26
• [Presentation] C-H Bond Hydroxylation Catalyzed by Manganese Porphycene in a Myoglobin Matrix (2014)
  • Author(s): Koji Oohora, Takashi Hayashi
  • Organizer: 錯体化学会第64会討論会
  • Place of Presentation: 中央大学後楽園キャンパス（東京都文京区）
  • Year and Date: 2014-09-18
  • Invited
• [Presentation] ミオグロビン変異体に挿入したポルフィセンマンガン錯体が触媒する水酸化反応の立体選択性 (2014)
  • Author(s): 西浦貴子、大洞光司、林高史
  • Organizer: 第8回バイオ関連化学シンポジウム
  • Place of Presentation: 岡山大学津島キャンパス（岡山県岡山市）
  • Year and Date: 2014-09-11
• [Remarks] 大阪大学大学院工学研究科林研究室
  • URL: http://www.chem.eng.osaka-u.ac.jp/~hayashiken/index.html
• [Remarks] 大阪大学 林研究室
  • URL: http://www.chem.eng.osaka-u.ac.jp/~hayashiken/index.html