細胞集団中のマイノリティのジェノタイプを一細胞レベルで同定する方法の開発

Publicly Offered Research

Project Area	Spying minority in biological phenomena -Toward bridging dynamics between individual and ensemble processes-
Project/Area Number	26115719
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Biological Sciences
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	城口克之国立研究開発法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 上級研究員 (00454059)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2016-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2015)
Budget Amount *help	¥12,090,000 (Direct Cost: ¥9,300,000、Indirect Cost: ¥2,790,000) Fiscal Year 2015: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000) Fiscal Year 2014: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Keywords	シークエンシング / 単一細胞解析 / バーコード / １細胞解析 / シークエンサ / ハイスループット
Outline of Annual Research Achievements	細菌を対象に、ゲノム配列の一部で菌種を同定し、１細胞の分解能で定量する方法の開発を行った。１細胞での計測を行うために、顕微鏡像を見ながら細胞をピックアップできるようにした。また、ドロプレットジェネレータを用いて細菌１つ１つをドロプレット中に入れてPCRを行った。通常のチューブ内での反応とは異なり微小体積からの増幅反応になるため、様々な条件を検討したが、最終的に増幅を確認できた。増幅後にドロプレットを壊して増幅DNAを回収する方法を検討して実現し、電気泳動で増幅産物の長さを解析した。その結果、細胞を区別するために加えたDNA配列（バーコード配列）が、ドロプレット内で目的配列に付加していることを確認できた。バーコード配列が付加していないものもあり、これを取り除く必要が生じたため、増幅用のプライマーを工夫し、目的以外のものをワンステップで取り除ける方法を確立した。ワンステップかつ短時間で行えるこの方法は、ハイスループット化を目指す際に有効である。続いて、数種類の既知のバクテリアを既知の比で混合したものを用いて、ドロプレット内で増幅し、同時にバーコード配列を付加した。ここでもバーコード配列が付加したことを確認できた。その後、この増幅産物を次世代シークエンサで解析した。その結果、シークエンシングによる菌数の定量値が、最初の菌の混合比と強い相関を示す結果を得ることができた。これは、混在したモデル菌において高精度な定量ができたことを意味する。さらに、マウスの糞便を用いた解析も行った。今後は、解析プログラムを開発し、未知の菌においても、ゲノム配列をベースとして一塩基分解能で菌を同定できることを示していく。そして、生物学的課題にチャレンジする。
Research Progress Status	27年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	27年度が最終年度であるため、記入しない。