新規エピゲノム分析によるクロマチン変異の解析

• Project Area: Dynamic chromatin structure and function
• Project/Area Number: 26116516
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 甲斐 雅亮 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 教授 (00160953)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000); Fiscal Year 2015: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000); Fiscal Year 2014: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
• Keywords: クロマチン / エピゲノム / ヒストン / DNA / 変異 / メチル化 / 蛍光反応 / 癌 / がん

Outline of Annual Research Achievements

DNAの塩基配列の変化を伴わない遺伝子の機能変化を解明するエピゲノム研究は、ヒストンの翻訳後修飾やDNAのメチル化などのクロマチン構造の変化を通して、個体の発生や細胞のがん化機構の解明などと密接に関連している。実際に、がんのエピゲノム研究では、特定遺伝子領域における高頻度なメチル化の出現など、がん特異的なクロマチン変異が報告されている。本研究では、シトシンに特異的な蛍光検出反応や修飾アミノ酸を含むタンパク質配列決定法等の新しい分析技術を応用し、メチル化シトシンを定量評価するメチローム解析の新技術、およびヒストン修飾を定性・定量的に解析できるタンパク質配列決定の新技法を開発して、新たながん標的遺伝子の発現を抑制する人工siRNAの創出を目的とした。
まず、メチル化シトシンを含む配列既知の39 bpからなる合成2本鎖DNAを用いて、加水分解したのち、DNA中のシトシンを蛍光反応によって定量できるか否かを調べた。その結果、加水分解反応や蛍光反応の条件を検討したところ、本測定法によって、メチル化シトシンの定量評価に成功した。
次に、正常細胞由来として繊維芽細胞、がん細胞由来としてHeLa細胞からヒストンを抽出し、3種類の酵素（トリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼK）によって分解した。分解ペプチドを蛍光誘導体化反応したのち、HPLC蛍光検出によって分離プロファイルの比較を行ったところ、両細胞由来のヒストンの間で、蛍光ピークの高さや位置の異なる複数のピークが観察された。この結果は、本測定法によって、アセチル化などのヒストン修飾部位が検出できることを示している。
現在、がん組織およびその周辺の正常組織からヒストンやDNAを抽出する方法を検討中であり、今回開発した測定法を用いた、がんおよび正常組織由来のクロマチン変異の解析へと進展させる予定である。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Facile preparation of streptavidin-coated sephadex beads and their application to chemiluminescence detection of a target DNA (2015)
  • Author(s): El-Mahdy AF, Ejupi V, Shibata T, Kabashima T, Lu J, Kai M
  • Journal Title: Mcrochimica Acta Volume: 182 Issue: 3-4 Pages: 495-503
  • DOI: 10.1007/s00604-014-1348-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Sensitive and selective determination of peptides, PG and PGP, using a novel fluorogenic reagent 4-chlorobenzene-1,2-diol (2015)
  • Author(s): Hasina Yasmin, Mohammed Shafikur Rahman, Takayuki Shibata,Tsutomu Kabashima, Masaaki Kai
  • Journal Title: Chemical Papers Volume: 69 Issue: 4 Pages: 504-509
  • DOI: 10.1515/chempap-2015-0057
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Sensitive and Selective Determination of Orotic Acid in Biological Specimens Using a Novel Fluorogenic Reaction. (2015)
  • Author(s): Yin S, Dragusha S, Ejupi V, Shibata T, Kabashima T, Kai M.
  • Journal Title: Journal of Fluorescence Volume: 25 Issue: 4 Pages: 1005-1011
  • DOI: 10.1007/s10895-015-1584-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Spectrofluorometric Assays of Human Collagenase Activity Using Native Collagen and Acetyl-Peptide Substrates (2015)
  • Author(s): Valon Ejupi, Shpend Dragusha, Tsutomu Kabashima, Qinchang Zhu, Ahmed F. M. El-Mahdy, Sheng Yin, Takayuki Shibata, Masaaki Kai
  • Journal Title: Advances in Enzyme Research Volume: 3 Issue: 01 Pages: 19-29
  • DOI: 10.4236/aer.2015.31003
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Chemiluminescence-imaging detection of DNA on a solid-phase membrane by using a peroxidase-labeled macromolecular probe (2015)
  • Author(s): Md. Golam Azam, M. Yamasuji, T. Krawczyk, T. Shibata, T. Kabashima,M. Kai
  • Journal Title: Talanta Volume: 139 Pages: 138-142
  • DOI: 10.1016/j.talanta.2015.03.005
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Fluorometric assay for phenotypic differentiation of drug-resistant HIV mutants. (2015)
  • Author(s): Zhu Q, Yu Z, Kabashima T, Yin S, Dragusha S, El-Mahdy AF, Ejupi V, Shibata T, Kai M
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 5 Issue: 1 Pages: 10323-10323
  • DOI: 10.1038/srep10323
  • NAID: 120006987048
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] DNA aptamers in the diagnosis and treatment of human diseases. (2015)
  • Author(s): Zhu Q, Liu G, Kai M
  • Journal Title: Molecules Volume: 20 Issue: 12 Pages: 20979-20997
  • DOI: 10.3390/molecules201219739
  • NAID: 120006987226
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Delivery of siRNA using siRNA/cationic vector complexes encapsulated in dendrimer-like polymeric DNAs (2015)
  • Author(s): Ahmed F. M. El-Mahdy, Takayuki Shibata, Tsutomu Kabashima, Qinchang Zhu and Masaaki Kai
  • Journal Title: RSC Adv. Volume: 5 Issue: 41 Pages: 32775-32785
  • DOI: 10.1039/c5ra01032b
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A Novel Fluorometric Method for the Selective Determination of Pro-Gly and Pro-Gly-Pro (2014)
  • Author(s): Yasmin H, Rahman MS, Shibata T, Kabashima T, Kai M
  • Journal Title: International Journal of Peptide Research and Therapeutics Volume: 20 Issue: 4 Pages: 441-446
  • DOI: 10.1007/s10989-014-9406-z
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Amplified and selective assay of collagens by enzymatic and fluorescent reactions (2014)
  • Author(s): Yasmin H, Kabashima T, Rahman MS, Shibata T, Kai M
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 4 Issue: 1 Pages: 4950-4950
  • DOI: 10.1038/srep04950
  • NAID: 120006986568
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Carbon Nanofiber-based Luminol-biotin Probe for Sensitive Chemiluminescence Detection of Protein (2014)
  • Author(s): Baj S, Krawczyk T, Pradel N, Azam MG, Shibata T, Dragusha S, Skutil K, Pawlyta M, Kai M
  • Journal Title: Analytical Sciences Volume: 30 Issue: 11 Pages: 1051-1056
  • DOI: 10.2116/analsci.30.1051
  • NAID: 130004704337
  • ISSN: 0910-6340, 1348-2246
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 新規蛍光反応によるDNA中のメチル化シトシン定量法の開発 (2016)
  • Author(s): 大島 澄佳、柴田 孝之、椛島 力、甲斐 雅亮
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（横浜市）
  • Year and Date: 2016-03-26
• [Presentation] ペプチドの新規蛍光検出反応およびHPLCによるヒストン修飾部位の解析 (2015)
  • Author(s): 柴田孝之、田上奈緒美、椛島力、甲斐雅亮
  • Organizer: 新アミノ酸分析研究会第5回学術講演会
  • Place of Presentation: 東京大学（東京）
  • Year and Date: 2015-12-07
• [Presentation] DNA アプタマーの HER2 発現細胞への導入 (2015)
  • Author(s): 安達杏奈、椛島力、柴田孝之、甲斐雅亮
  • Organizer: 第32回日本薬学会九州支部大会
  • Place of Presentation: 九州保健福祉大学（延岡市）
  • Year and Date: 2015-11-28
• [Presentation] プリオンタンパク質の加熱処理によるプロテアーゼ抵抗性への影響 (2015)
  • Author(s): 陣内伸俊、椛島力、柴田孝之、甲斐雅亮
  • Organizer: 第32回日本薬学会九州支部大会
  • Place of Presentation: 九州保健福祉大学（延岡市）
  • Year and Date: 2015-11-28
• [Presentation] 新規蛍光反応によるヒストン修飾解析法の開発 (2015)
  • Author(s): 田上奈緒美、椛島力、柴田孝之、甲斐雅亮
  • Organizer: 第32回日本薬学会九州支部大会
  • Place of Presentation: 九州保健福祉大学（延岡市）
  • Year and Date: 2015-11-28
• [Presentation] Platforms of luminescence in analytical chemistry for nucleic acids (2015)
  • Author(s): Jianzhong Lu、Masaaki Kai
  • Organizer: 日本分析化学会第64年会
  • Place of Presentation: 九州大学（福岡市）
  • Year and Date: 2015-09-11
  • Invited
• [Presentation] Fluorometric assay of dihydroorotate dehydrogenase activity and orotic acid concentration in a cell lysate (2015)
  • Author(s): Sheng Yin、Tsutomu Kabashima、Takayuki Shibata、Masaaki Kai
  • Organizer: 日本分析化学会第64年会
  • Place of Presentation: 九州大学（福岡市）
  • Year and Date: 2015-09-09
• [Presentation] Collagenase activity and its stimulation in cultured cells by spectrofluorometric evaluation (2015)
  • Author(s): Valon Ejupi、Tsutomu Kabashima、Takayuki Shibata、Masaaki Kai
  • Organizer: 日本分析化学会第64年会
  • Place of Presentation: 九州大学（福岡市）
  • Year and Date: 2015-09-09
• [Presentation] DNAアプタマー-siRNAによるHIVプロテアーゼの発現抑制効果 (2015)
  • Author(s): 安達杏奈、朱欽昌、椛島力、柴田孝之、甲斐雅亮
  • Organizer: 第28回バイオメディカル分析科学シンポジウム（BMAS2015）
  • Place of Presentation: 長崎大学（長崎市）
  • Year and Date: 2015-08-21
• [Presentation] 3,4-DHPAA蛍光反応の新規プロリダーゼ活性測定法への応用 (2015)
  • Author(s): 椛島 力、曽宮 実和子、柴田 孝之、甲斐 雅亮
  • Organizer: 日本薬学会第135年会
  • Place of Presentation: 神戸サンボーホール（神戸市）
  • Year and Date: 2015-03-25 – 2015-03-28
• [Presentation] ペプチドに特異的な蛍光反応を用いたHIV/HCV 識別法の開発 (2014)
  • Author(s): 川島 歌織、椛島 力、柴田 孝之、甲斐 雅亮
  • Organizer: 第31回日本薬学会九州支部大会
  • Place of Presentation: 第一薬科大学（福岡市）
  • Year and Date: 2014-12-06 – 2014-12-07
• [Presentation] 3,4-DHPAA を用いた新規プロリダーゼ活性測定法の開発 (2014)
  • Author(s): 曽宮 実和子、椛島 力、柴田 孝之、甲斐 雅亮
  • Organizer: 第31回日本薬学会九州支部大会
  • Place of Presentation: 第一薬科大学（福岡市）
  • Year and Date: 2014-12-06 – 2014-12-07
• [Presentation] Dihydroorotate dehydrogenase assay using a specific fluorescence reaction (2014)
  • Author(s): 尹 晟、椛島 力、柴田 孝之、甲斐 雅亮
  • Organizer: 日本分析化学会第63年会
  • Place of Presentation: 広島大学（東広島市）
  • Year and Date: 2014-09-17 – 2014-09-19
• [Presentation] Assay of collagenase activity in human cells using a novel fluorescence reaction (2014)
  • Author(s): Valon Ejupi、椛島 力、柴田 孝之、甲斐 雅亮
  • Organizer: 日本分析化学会第63年会
  • Place of Presentation: 広島大学（東広島市）
  • Year and Date: 2014-09-17 – 2014-09-19
• [Patent(Industrial Property Rights)] ア ミノ酸およびペプチドの検出方法ならびに検出試薬 (2016)
  • Inventor(s): 甲斐雅亮、椛島 力、柴田孝之
  • Industrial Property Rights Holder: 永崎大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2016-014936
  • Filing Date: 2016-01-26