哺乳類細胞での合成生物学を志向した次々世代型ジェネティックエンジニアリング技術

• Project Area: Synthetic biology for the comprehension of biomolecular networks
• Project/Area Number: 26119703
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 野村 渉 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 准教授 (80463909)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥13,260,000 (Direct Cost: ¥10,200,000、Indirect Cost: ¥3,060,000); Fiscal Year 2015: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000); Fiscal Year 2014: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: タンパク質 / DNA / ゲノム編集 / CRISPR-Cas / テロメア / hTERT / CRISPR/Cas

Outline of Annual Research Achievements

本研究では哺乳類細胞のゲノムに特化した技術、任意の標的配列を編集もしくは改変できる技術としてヌクレアーゼによるゲノム編集技術であるZFN、TALEN、CRISPR-Cas9システムの3技術の各特長を組み合わせ、合成生物学研究に利用できる基盤技術としての体系化を推進した。その成果として、ラパマイシンにより会合が誘導されるFKBP-FRBドメインを利用したDNA切断系の構築と転写制御システムへの応用が挙げられる。ZF、TALEドメインにFKBPを融合し、FokIドメインにFRBを融合させたタンパク質を構築した。ZFN、TALENでは標的配列上でFokIドメインが二量体形成してDNA切断が誘導される。DNA結合ドメインとFokIドメインをつなぐリンカー部分にFKBP、FRBを導入し、ラパマイシン添加によって二量体形成が再現される仕組みとした。各ドメインをin vitro translationで得て、in vitroでの標的DNA切断実験を行った。その結果、ZFNとTALE-FKBP/FRB-FokIの組み合わせで切断が確認された。リンカー部分にFKBP-FRB会合ドメインを利用しているため、標的配列の最適化によってより高い切断効率が得られると予測されるため今後の課題としている。ラパマイシンによる転写活性制御においてはTALEドメイン／dCas9を基にIL-1RNプロモーター領域に結合するDNA結合タンパク質を作製し、ラパマイシン存在下において、転写活性化または抑制ドメインと会合して転写活性制御ができる仕組みを構築した。哺乳類細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイによってラパマイシン添加の有無によって遺伝子発現調節のon/offが可能であり、プロモーター領域の複数箇所を標的とすることで各人工転写因子の協奏的な効果が得られた。また、内因性遺伝子プロモーターにも適用可能であった。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Application and Potential of Genome Engineering by Artificial Enzymes (2015)
  • Author(s): 野村 渉
  • Journal Title: YAKUGAKU ZASSHI Volume: 135 Issue: 3 Pages: 405-414
  • DOI: 10.1248/yakushi.14-00240-5
  • NAID: 130004756508
  • ISSN: 0031-6903, 1347-5231
  • Year and Date: 2015-03-01
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ターゲットタンパク質を特異的に認識するプローブ (2014)
  • Author(s): 野村 渉、玉村 啓和
  • Journal Title: 化学工業 Volume: 65 Pages: 8-14
• [Journal Article] Screening for Protein Kinase C Ligands Using Fluorescence Resonance Energy Transfer (2014)
  • Author(s): Ohashi N, Nomura W, Minato N, Tamamura H.
  • Journal Title: Chemical and Pharmaceutical Bulletin Volume: 62 Issue: 10 Pages: 1019-1025
  • DOI: 10.1248/cpb.c14-00419
  • NAID: 130004677396
  • ISSN: 0009-2363, 1347-5223
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of a fluoride-responsive amide bond cleavage device that is potentially applicable to a traceable linker (2014)
  • Author(s): J. Yamamoto, N. Maeda, C. Komiya, T. Tanaka, M. Denda, K. Ebisuno, W. Nomura, H. Tamamura, Y. Sato, A. Yamauchi, A. Shigenaga, and A. Otaka
  • Journal Title: Tetrahedron Volume: 70 Issue: 34 Pages: 5122-5127
  • DOI: 10.1016/j.tet.2014.05.110
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Development of the 8-aza-3-bromo-7-hydroxycoumarin-4-ylmethyl group as a new entry of photolabile protecting groups (2014)
  • Author(s): Takano, H., Narumi, T., Ohashi, N., Suzuki, A., Furuta, T., Nomura, W., Tamamura, H.
  • Journal Title: Tetrahedron Volume: XX Issue: 29 Pages: 4400-4404
  • DOI: 10.1016/j.tet.2014.04.063
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of a traceable linker containing a thiol-responsive amino acid for the enrichment and selective labelling of target proteins (2014)
  • Author(s): J. Yamamoto, M. Denda, N. Maeda, M. Kita, C. Komiya, T. Tanaka, W. Nomura, H. Tamamura, Y. Sato, A. Yamauchi, A. Shigenaga, and A. Otaka
  • Journal Title: Org. Biomol. Chem. Volume: 12 Issue: 23 Pages: 3821-3826
  • DOI: 10.1039/c4ob00622d
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Efficient conversion of genomic promoter region by genome engineering systems (2015)
  • Author(s): Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: Pacifichem 2015
  • Place of Presentation: ホノルル（アメリカ合衆国）
  • Year and Date: 2015-12-15
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Simultaneous digestion by site-specific nucleases for efficient gene deletion: Study of hTERT promoter function (2015)
  • Author(s): Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: Conference on Transposition and Genome Engineering 2015
  • Place of Presentation: 奈良春日野国際フォーラム（奈良県・奈良市）
  • Year and Date: 2015-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Genome Deletion by ZFN and CRISPR-Cas Targeting Promoter Region for Analysis of hTERT Function (2015)
  • Author(s): Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: 細胞を創る 研究会8.0
  • Place of Presentation: 大阪大学吹田キャンパス銀杏会館（大阪府・吹田市）
  • Year and Date: 2015-11-12
• [Presentation] 人工転写因子の協奏的な働きによる遺伝子発現調節機構の構築 (2015)
  • Author(s): 杉井太亮、野村 渉、玉村啓和
  • Organizer: 第59回日本薬学会関東支部大会
  • Place of Presentation: 日本大学薬学部（千葉県・船橋市）
  • Year and Date: 2015-09-12
• [Presentation] 配列特異的分割型DNAメチル化酵素の作用機構解析 (2015)
  • Author(s): 野村 渉、大浦伊代、玉村啓和
  • Organizer: 第59回日本薬学会関東支部大会
  • Place of Presentation: 日本大学薬学部（千葉県・船橋市）
  • Year and Date: 2015-09-12
• [Presentation] ペプチド性機能分子のデザインと応用 (2015)
  • Author(s): 野村 渉
  • Organizer: 第47回若手ペプチド夏の勉強会
  • Place of Presentation: アスティかたおか（長野県・塩尻市）
  • Year and Date: 2015-08-11
  • Invited
• [Presentation] 遺伝子を標的とした創薬ケミカルバイオロジー研究 (2015)
  • Author(s): 野村 渉
  • Organizer: 長浜バイオ大学大学院講義
  • Place of Presentation: 長浜バイオ大学（滋賀県・長浜市）
  • Year and Date: 2015-08-10
  • Invited
• [Presentation] ゲノム編集技術を用いた複数箇所切断によるプロモーター領域の配列変換 (2015)
  • Author(s): 野村 渉、増田朱美、玉村啓和
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第10回年会
  • Place of Presentation: 東北大学川内キャンパス萩ホール（宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2015-06-10
• [Presentation] 人工DNA修飾酵素の構築戦略とゲノム・エピゲノム編集への展開 (2015)
  • Author(s): 野村 渉
  • Organizer: 日本薬学会第135年会
  • Place of Presentation: 神戸学院大学
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-28
  • Invited
• [Presentation] ゲノム編集法による効率的な配列欠損反応 (2014)
  • Author(s): 野村渉、増田朱美、玉村啓和
  • Organizer: 細胞を創る会7.0
  • Place of Presentation: 東京大学弥生講堂
  • Year and Date: 2014-11-13 – 2014-11-14
• [Presentation] プロモーター領域を標的としたDNA二重鎖切断による配列欠損反応の解析 (2014)
  • Author(s): 野村渉、増田朱美、玉村啓和
  • Organizer: 第4回ゲノム編集研究会
  • Place of Presentation: 広島国際会議場
  • Year and Date: 2014-10-06 – 2014-10-07
• [Presentation] ゲノム編集法による複数箇所同時切断が示す配列欠損反応効率の向上 (2014)
  • Author(s): 野村渉、増田朱美、玉村啓和
  • Organizer: 第8回バイオ関連化学シンポジウム
  • Place of Presentation: 岡山大学津島キャンパス
  • Year and Date: 2014-09-11 – 2014-09-13
• [Presentation] Efficient Gene Disruption at hTERT Promoter Region by Simultaneous Digestion by Pairs of ZFNs or Guide RNAs of CRISPR/Cas System (2014)
  • Author(s): Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: The 28th Annual Symposium of Protein Society
  • Place of Presentation: San Diego, USA
  • Year and Date: 2014-07-27 – 2014-07-30
  • Invited
• [Presentation] Enhanced Gene Disruption at Specific Promoter Region By Simultaneous Digestion of ZFN or CRISPR/Cas System (2014)
  • Author(s): Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: The Synthetic Biology: Engineering, Evolution & Design (SEED) conference 2014
  • Place of Presentation: Manhattan Beach, USA
  • Year and Date: 2014-07-14 – 2014-07-17
• [Presentation] Enhanced Gene Disruption by Simultaneous Digestion of ZFN or CRISPR/Cas System at hTERT Promoter Region (2014)
  • Author(s): Wataru Nomura, Akemi Masuda, Hirokazu Tamamura
  • Organizer: FASEB SRC "Genome Engineering Cutting-Edge Research and Applications
  • Place of Presentation: Nassau, Bahamas
  • Year and Date: 2014-06-22 – 2014-06-27
• [Book] pp19-20, Peptide Science 2014, Akira Otaka (Ed.) (2015)
  • Author(s): Takano H, Narumi T, Ohashi N, Nomura W, Furuta T, Tamamura H.
  • Total Pages: 369
  • Publisher: The Japanese Peptide Society, Osaka
• [Book] pp75-76, Peptide Science 2014, Akira Otaka (Ed.) (2015)
  • Author(s): Nomura W, Koseki T, Mizuguchi T, Tamamura H.
  • Total Pages: 369
  • Publisher: The Japanese Peptide Society, Osaka
• [Book] pp103-104, Peptide Science 2014, Akira Otaka (Ed.) (2015)
  • Author(s): Honda Y, Mizuguchi T, Nomura W, Tamamura H.
  • Total Pages: 369
  • Publisher: The Japanese Peptide Society, Osaka
• [Remarks] 東京医科歯科大学 玉村研究室 ホームページ
  • URL: http://tamamura-tmd.sakura.ne.jp/