リン脂質代謝系を組み込んだ人工細胞の構築

• Project Area: Synthetic biology for the comprehension of biomolecular networks
• Project/Area Number: 26119704
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 車 兪徹 東京工業大学, 地球生命研究所, WPI研究員 (40508420)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥14,430,000 (Direct Cost: ¥11,100,000、Indirect Cost: ¥3,330,000); Fiscal Year 2015: ¥7,280,000 (Direct Cost: ¥5,600,000、Indirect Cost: ¥1,680,000); Fiscal Year 2014: ¥7,150,000 (Direct Cost: ¥5,500,000、Indirect Cost: ¥1,650,000)
• Keywords: 合成生物学 / 人工細胞 / リン脂質 / 脂質 / ゲノム / バイオテクノロジー

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、細胞膜を構成する主要なリン脂質の、最小合成経路をリデザインし、無細胞系をベースとした再構築を試みることである。リン脂質の生合成反応は網目状のネットワーク構造を形成しており、多くの酵素が関わる複雑な生体システムである。これまでにArchaeaの脂質生合成経路を大腸菌などの生物種で部分的に再構築した例は２、３あるが、In vitroで再構築した例は無く、また統合的な解析を行うための技術基盤も確立されていない。そこでリン脂質合成に関わる最小限の酵素8種を選別し無細胞系により合成することで、リン脂質合成代謝系をボトムアップ的に再構築する。これにより、リン脂質代謝をモデルとした膜タンパク質分子間ネットワークを無細胞内再構築することを目的とする。
合成する酵素は膜局在タンパク質であるため、その局在場所としてNanoDisc（脂質二重膜をディスク状に束ねたもの）やリポソームを無細胞系に投入した。本研究計画において、plsB、plsC、cdsA、pssA、psd、pgsA、pgpA、cls遺伝子の無細胞発現を確認し、またそれら合成産物の約80%以上がNanodis膜への自発的挿入していることを確認した。plsBとplsCについては以前からアシルトランスフェラーザ活性の検出に成功していたが、今回さらにcdsAについてその活性の一端を検出する結果が得られている。また関連技術として、巨大膜小胞（GUV）内においてモデル膜タンパク質である、アルファヘモリジンとバクテリオロドプシン（それぞれGFPフージョンプロテインとして）を合成させたところ、効率的なGUV内合成と、GUV膜挿入を顕微鏡下で観察することができた。
本研究で得られた成果は、これまでに理想的な手段がなかった、脂質膜環境中でどのような分子ダイナミクスが行なわれているかを詳細に解析する、試験管内技術の創造に資するものである。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] 膜 (2016)
  • Author(s): 車 兪澈、上田卓也,
  • Journal Title: 「生物物理」学会誌 Volume: in press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PUREシステムを用いた膜タンパク質の無細胞合成, (2016)
  • Author(s): 車 兪澈、上田卓也,
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 34.3 Pages: 471-476
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins. (2015)
  • Author(s): Y. Kuruma and T. Ueda
  • Journal Title: Nature Protocols Volume: in press
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Introduction to the Special Issue : A workshop in Association with the Origins 2014 Meeting (2015)
  • Author(s): Pier Luigi luisi, Yutetsu Kuruma
  • Journal Title: Origins of Life and Evolution of Biospheres Volume: in press Issue: 4 Pages: 267-268
  • DOI: 10.1007/s11084-014-9391-4
• [Journal Article] Cell-Free Synthesis of SecYEG Translocon as the Fundamental Protein Transport Machinery (2014)
  • Author(s): Hideaki Matsubayashi, Yutetsu Kuruma, Takuya Ueda.
  • Journal Title: Origins of Life and Evolution of Biospheres. Volume: 44 Issue: 4 Pages: 331-334
  • DOI: 10.1007/s11084-014-9389-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] In Vitro Synthesis of the E. coli Sec Translocon from DNA. (2014)
  • Author(s): Hideaki Matsubayashi, Yutetsu Kuruma, Takuya Ueda.
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition. Volume: 53 Issue: 29 Pages: 7535-7538
  • DOI: 10.1002/anie.201403929
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The PURE system for protein production (2014)
  • Author(s): Shimizu, Y.
  • Journal Title: Methods Mol Biol Volume: 1118 Pages: 275-284
  • DOI: 10.1007/978-1-62703-782-2_19
  • ISBN: 9781627037815, 9781627037822
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Construction of Self-Reproducing Minimal Cell, (2015)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma,
  • Organizer: International WorkShop on Challenge to Synthesizing Life
  • Place of Presentation: Hakone, Japan
  • Year and Date: 2015-08-25
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Fatty acid synthesis inside giant unilamellar vesicle -Toward the construction of self-reproducing protocell-, (2015)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma,
  • Organizer: International Symposium on Fluctuation and Structure out of Equilibrium 2015 (SFS2015)
  • Place of Presentation: Kyoto, Japan
  • Year and Date: 2015-08-20
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Construction of Self-reproducing Minimal Cell, (2015)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma,
  • Organizer: Sattelite Workshop “The 1st Workshop on Synthetic Natural Systems”, in ECAL2015
  • Place of Presentation: York, UK
  • Year and Date: 2015-07-20
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 合成生物学：原始的細胞膜を再構築する (2015)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma
  • Organizer: 冥王代生命学の創生 第２回シンポジウム
  • Place of Presentation: 長野県白馬
  • Year and Date: 2015-03-13 – 2015-03-15
  • Invited
• [Presentation] Reconstruction of cell membrane function (2015)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma
  • Organizer: RNA, Peptides, Vesicles and Exoplanets
  • Place of Presentation: Boston, USA
  • Year and Date: 2015-02-26 – 2015-02-27
  • Invited
• [Presentation] Cell-free synthesis of Sec translocon on liposome membrane (2015)
  • Author(s): Hideaki Matsubayashi, Yutetesu Kuruma, Takuya Ueda
  • Organizer: Biophysical Society 59th Annual Meeting
  • Place of Presentation: Maryland, USA
  • Year and Date: 2015-02-07 – 2015-02-11
• [Presentation] Construction of artificial cell membrane for the study of the origin and evolution of life (2015)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma
  • Organizer: The 3rd ELSI (Earth-Life Science Institute) International Symposium
  • Place of Presentation: Tokyo
  • Year and Date: 2015-01-13 – 2015-01-15
• [Presentation] Fatty Acid Synthesis Inside Giant Unilameller Vesicle - Toward the construction of self-reproducing protocell- (2014)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma
  • Organizer: 領域横断研究会「細胞力学と細胞運動の協奏」
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2014-12-19 – 2014-12-20
• [Presentation] 無細胞翻訳系による SecYEG トランスロコンの合成 (2014)
  • Author(s): 松林 英明, 車 兪徹, 上田 卓也
  • Organizer: 第３７回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [Presentation] Sec transloconのin vitro再構成 (2014)
  • Author(s): 松林 英明, 車 兪徹, 上田 卓也
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会7.0
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2014-11-13 – 2014-11-14
• [Presentation] 無細胞タンパク質合成系を用いた細胞分裂系の再構成 (2014)
  • Author(s): 古里 匠, 松林 英明, 車兪徹、上田 卓也
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会7.0
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2014-11-13
• [Presentation] PURE systemによる膜タンパク質合成システムの構築 (2014)
  • Author(s): 松林英明、車兪徹、西山賢一、上田卓也
  • Organizer: 第９回無細胞生命科学研究会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2014-10-08 – 2014-10-09
• [Presentation] 無細胞タンパク質合成系を用いた細胞分裂系の再構成 (2014)
  • Author(s): 古里 匠, 松林 英明, 車兪徹、上田 卓也
  • Organizer: 第９回無細胞生命科学研究会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2014-10-08 – 2014-10-09
• [Presentation] 無細胞翻訳系による SecYEG トランスロコンの合成 (2014)
  • Author(s): 松林 英明, 車 兪徹, 上田 卓也
  • Organizer: 第５２回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] 自己複製可能な人工細胞の構築に向けて (2014)
  • Author(s): 車 兪徹
  • Organizer: 第2回「ゆらぎと構造の協奏」領域研究会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2014-08-29 – 2014-08-31
  • Invited
• [Presentation] 生命の誕生に必須な膜の形成―ボトムアップとトップダウンアプローチ― (2014)
  • Author(s): 車 兪徹
  • Organizer: 日本進化学会 第16回大阪大会
  • Place of Presentation: 高槻
  • Year and Date: 2014-08-21 – 2014-08-24
  • Invited
• [Presentation] In vitro reconstruction of functional cell membrane (2014)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma
  • Organizer: Satellite workshop in ALIFE 14 "What can Synthetic Biology offer to (Embodied) Artificial Intelligence? SB-AI 2014"
  • Place of Presentation: New York, USA
  • Year and Date: 2014-07-30 – 2014-08-02
  • Invited
• [Presentation] In Vitro Reconstruction of Functional Membrane (2014)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma
  • Organizer: ALIFE14
  • Place of Presentation: New York, USA
  • Year and Date: 2014-07-30 – 2014-08-02
• [Presentation] In Vitro Synthesis of Sec Translocon from DNA (2014)
  • Author(s): Hideaki Matsubayashi, Yutetsu Kuruma, Takuya Ueda
  • Organizer: Open Questions of the Origin of Life 2014
  • Place of Presentation: Kyoto, Japan
  • Year and Date: 2014-07-12 – 2014-07-13
• [Presentation] Creation a possible living organism that might exist in an early earth condition (2014)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma
  • Organizer: ORIGINS2014
  • Place of Presentation: Nara, japan
  • Year and Date: 2014-07-06 – 2014-07-11
• [Presentation] 人工細胞の構築に向けた生体膜機能の再構築 (2014)
  • Author(s): 車 兪徹
  • Organizer: 首都大バイオ・ソフトマターセミナー
  • Place of Presentation: 首都大学東京
  • Year and Date: 2014-06-12
  • Invited
• [Presentation] 人工細胞の構築に向けた生体膜機能の再構築 (2014)
  • Author(s): 車 兪徹
  • Organizer: 第11回21世紀大腸菌研究会
  • Place of Presentation: 岩手
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-06
• [Presentation] 無細胞翻訳系による SecYEG トランスロコンの合成 (2014)
  • Author(s): 松林 英明, 車 兪徹, 上田 卓也
  • Organizer: 第11回21世紀大腸菌研究会2014
  • Place of Presentation: 岩手
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-06
• [Book] Artificial Life 14 (2014)
  • Author(s): Yutetsu Kuruma, Hideaki Matsubayashi and Takuya Ueda.
  • Total Pages: 2
  • Publisher: The MIT press
• [Remarks] 機能性細胞膜の合成に成功、人工細胞にむけて大きな一歩
  • URL: http://www.elsi.jp/ja/news/highlights/2014/06/001221.html