DNA-タンパク質相互作用の光制御を利用した遺伝子回路への光分子スイッチの導入

• Project Area: Synthetic biology for the comprehension of biomolecular networks
• Project/Area Number: 26119705
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 清尾 康志 東京工業大学, 生命理工学研究科, 准教授 (20313356)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥13,260,000 (Direct Cost: ¥10,200,000、Indirect Cost: ¥3,060,000); Fiscal Year 2015: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000); Fiscal Year 2014: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
• Keywords: 光ケージド核酸 / シュードデオキシウリジン / T7-RNAポリメラーゼ / Klenowフラグメント / 光ケージ / 人工遺伝子回路 / DNA-タンパク質相互作用

Outline of Annual Research Achievements

新規ケージドヌクレオシドとして、1-(2-ニトロベンジル）-2'-デオキシシュードウリジンを設計し、それを含むDNAの化学合成とその三リン酸体の合成とT7-RNAポリメラーゼ反応への適用を検討した。まず、上記ヌクレオシドを2'-デオキシシュードウリジンから合成し、ホスホロアミダイトへと誘導した後、DNA自動合成機を用いてDNAを合成した。
合成したDNAと相補鎖DNAからなる光ケージされたDNA二重鎖を用いてT7-RNAポリメラーゼによる転写反応を行った。その結果、光ケージされたDNA二重鎖と2-ニトロベンジル基を光で除去したDNAを比較すると、後者の方がより効率的に転写されることが分かった。これにより、光照射により転写効率を制御することのできる人工DNAを開発することができた。
またこれらの結果からDNAのメジャーグルーブ側につきだした芳香環が効率的にDNA結合タンパク質と相互作用する可能性が示唆されたため核酸塩基の７位に芳香環を導入した誘導体を種々合成し、その性質を調べたところベンゾフラン-2-イル基を導入した誘導体が蛍光特性を有し、かつその蛍光がDNA結合タンパク質の結合によりOn-offされるあらたな知見も見出した。また上記ヌクレオシドを三リン酸体への変換し、DNA鎖へのKlenowフラグメントによる取り込み反応を検討したところ、合成したヌクレオシド三リン酸はチミジン三リン酸の替わりにDNA鎖に組み込まれることが分かった。上記ヌクレオシドはチミジン三リン酸の代替基質として、アデニンの相補的位置に取り込まれる事もわかった。
以上の結果から、今回合成した1-(2-ニトロベンジル）-2'-デオキシシュードウリジンとその三リン酸はDNA合成酵素によりDNA鎖に取り込むことができ、かつT7-RNAポリメラーゼの転写効率を制御する新規光ケージドヌクレオシドであることが分かった。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] 7-(Benzofuran-2-yl)-7-deazadeoxyguanosine as a fluorescence turn-ON probe for single-strand DNA binding protein (2016)
  • Author(s): Munefumi Tokugawa, Yoshiaki Masaki, Jan Christian Canggadibrata, Kazuhei Kaneko, Takashi Shiozawa, Takashi Kanamori, Morten Grøtli, L. Marcus Wilhelmsson, Mitsuo Sekine and Kohji Seio
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 52 Issue: 19 Pages: 3809-3812
  • DOI: 10.1039/c5cc09700b
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] DNA-タンパク質相互作用の光制御をめざした光ケージされたデオキシシュードウリジンを含む核酸の合成および性質 (2016)
  • Author(s): 竹下玲央 大野健太郎 正木慶昭 関根光雄 清尾康志
  • Organizer: 日本化学会第９６春季年会
  • Place of Presentation: 同志社大学京田辺キャンパス
  • Year and Date: 2016-03-27
• [Presentation] Synthesis of oligonucleotides containing photo-caged 2’-deoxypseudouridine for the regulation of DNA-protein interaction (2015)
  • Author(s): Kentaro Ohno, Leo Takeshita, Yoshihiro Iijima, Takashi Kanamori, Yoshiaki Masaki, Mitsuo Sekine, Kohji Seio
  • Organizer: The 42th International symposium on nucleic acids chemistry
  • Place of Presentation: I-messae hall, Himeji
  • Year and Date: 2015-09-24
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 光ケージドヌクレオシド三リン酸の合成と性質 (2015)
  • Author(s): 大野健太郎 正木慶昭 金森功吏 関根光雄 清尾康志
  • Organizer: 第１７回日本RNA学会年会
  • Place of Presentation: ホテルライフォート札幌
  • Year and Date: 2015-07-15
• [Presentation] 光分解性保護基を有するデオキシシュードウリジンの合成と 性質 (2015)
  • Author(s): 飯島良紘 竹下玲央 大野健太郎 金森功 吏 正木慶昭 関根光雄 清尾康志
  • Organizer: 第 95日本化学会 春季年会プログラム
  • Place of Presentation: 日本大学 船橋キャンパス
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [Presentation] 光分解性保護基を有する核酸の合成および性質評価 (2014)
  • Author(s): 大野 百合惠 大野 健太郎 金森 功吏 正木 慶昭 大窪 章 寛 関根光雄 清尾康志
  • Organizer: 第１６回日本RNA学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋市・ウインクあいち
  • Year and Date: 2014-07-23 – 2014-07-25