2016 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質キャビティーを反応場として駆使する新触媒の創製
| Project Area | Precise Formation of a Catalyst Having a Specified Field for Use in Extremely Difficult Substrate Conversion Reactions |
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| Project/Area Number |
15H05804
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
林 高史 大阪大学, 工学研究科, 教授 (20222226)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 反応場 / 生体分子 / 生体触媒 / ヘム / 補因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内での生合成や代謝反応の多くは、酵素が介在し、基質選択性と生成物の立体制御を伴いながら温和な条件下で速やかに進行している。酵素が優れた触媒である主な要因は、長い年月の進化を経て最適化された活性中心とその周辺近傍の精密な分子構造が形成する反応場を有することにある。したがって、我々が新しい触媒を構築する際には、酵素の精巧な反応場を学ぶことが、きわめて有意義である。本研究では、タンパク質の空孔に非天然金属錯体を挿入した新しい反応場を構築し、天然の金属錯体の活性を凌駕する人工生体触媒の構築や、天然では見られない有機反応を触媒する新しい金属酵素の開発が目的である。
当該年度は、βバレル構造を有するタンパク質として、nitrobindin(NB)に着目した。このタンパク質は、本来はβバレル構造の空孔にヘム分子が結合し、NOを捕捉する役割を果たしていると考えられている。今回は、ヘムが存在せず、かつ空孔内に１つのみシステイン残基が存在するNB変異体を大腸菌によって発現し、得られた安定な空孔を反応場とする触媒構築を以下の２つの観点から試みた。
（１）NBの内部空孔にマレイミド基を側鎖に有するπ系分子を共有結合で導入してユニークな基質認識部位を作成し、位置選択的Diels-Alder反応の反応場として利用した。マレイミド基を側鎖に有するピレン環を用いて、NBの空孔内にピレンを配置することにより、アザカルコンとシクロペンタジエンの反応がエナンチオ選択的に進行すること確認した。
（２）側鎖にマレイミド基を有する鉄二核カルボニルクラスターを合成し、NBと反応させることにより、鉄錯体を空孔内に配置させ、ヒドロゲナーゼモデルとしての評価を行った。Ru錯体を共存させ、光励起に基づくRu錯体から鉄二核クラスターへの電子移動により、触媒的に水素発生が起こることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
NBはヘム補因子の存在しないアポ体でも、きわめて安定なβバレル構造を維持していることが知られている。この点に我々は着目し、マレイミド基を側鎖に有する化合物をNB空孔内の96番目アミノ酸残基をCysに置換したNB(Q96C)変異体と反応させることで、βバレルの化学修飾を行った。以下、２つのテーマについてその進捗状況を記す。
（１）ベンゼン、ナフタレン、ピレンそれぞれにマレイミドを修飾した化合物をNB(Q96C)と反応させ、βバレル空孔内にπ系分子を修飾した。これに対し、アザカルコンとシクロペンタジエン及びCu(II)イオンを加え、Diels-Alder反応を行った。その結果、ピレン修飾NBの場合、生成物のendo/exoの比は96:4で、エナンチオマー選択性も78%eeまで向上した。ちなみに、NBが存在しない系では、反応は進行するものの生成物のエナンチオマー選択性はほぼゼロであった。また、ベンゼン、ナフタレンを修飾した場合も数パーセントの選択性にとどまり、ピレン修飾NBの場合のみ、タンパク質空孔内の不斉環境の効果が働き、生成物のエナンチオマー選択性の顕著な向上が見られた。
（２）プロパンジチオラート配位子を有する鉄二核カルボニル錯体をNBに共有結合で修飾した複合体を調製し、Ru錯体と犠牲試薬アスコルビン酸を添加して、光照射下で水素発生を観測した。１時間でほぼ触媒回転数(TON)が80～90に到達した。TONを向上させるために、プロパンジチオラート配位子の中心の炭素原子を窒素原子に変換し、さらにその近傍の100番目アミノ酸をAspに変異させることにより、TONは130～140に上昇した。TONが向上した理由は、NBの空孔内への効率的プロトンシャトルの形成によるものと考えられる。このことは、X線結晶構造解析とMD計算によるNB複合体の想定される空孔内の構造からも示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の研究の成果から、NBは反応に適した場を与え、我々の手でさらにNBの空孔内の構造や極性環境を化学修飾や変異導入でチューニングすることにより、触媒反応の活性構造を制御可能であることを示した。特に、これまでの研究で、NO結合ヘムタンパク質であるNBは、構造が非常に安定であり、ヘムを除去した後のアポ体も、ヘムを除去する前のホロ体とほとんどβバレル構造に変化が無いことが明らかなので、βバレル内側のアミノ酸変異によって、挿入した金属錯体周囲の環境も、作成する前に計算によって予測可能である。そこで、我々はタンパク質のMD計算を駆使して、錯体周囲の第２配位圏の構造を予測し、錯体にどんな方向で基質が接近し、どのような立体の生成物を選択的に誘導するかについて、それなりの情報を得られることが可能である。したがって、我々は事前に、人工金属タンパク質の活性中心およびその周辺の構造の最適化を図り、さらなる安定かつ高活性の酵素類似触媒の開発を行いたい。
特に（１）については、様々なπ系化合物の修飾や、修飾位置の検討により、反応の選択性との相関を検討する。また、現時点ではCysの側鎖末端にπ系化合物を修飾しているが、今後は非天然アミノ酸の導入による反応場の構築も視野に入れたい。一方（２）については、空孔内へのプロトンシャトルの導入が効果的であることが判明したため、さらに鉄２価カルボニル錯体の近傍のアミノ酸に関して、幾つか変異導入を実施し、より効率の良い水素発生触媒の構築をめざす予定である。
さらに、上記の反応だけでなく、C-H結合の活性化やC-C結合形成、あるいは水素発生やCO2固定など、難易度の高い物質変換に焦点をあて、天然では見られない反応を選択的に行う人工金属酵素の開発を推し進める。
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Research Products
(12 results)
