2018 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質キャビティーを反応場として駆使する新触媒の創製
| Project Area | Precise Formation of a Catalyst Having a Specified Field for Use in Extremely Difficult Substrate Conversion Reactions |
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| Project/Area Number |
15H05804
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
林 高史 大阪大学, 工学研究科, 教授 (20222226)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 反応場 / 生体分子 / 生体触媒 / ヘム / 補因子 / アルカンの水酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内で繰り広げられる生合成や代謝反応の多くは、酵素が介在し、基質選択性と生成物の立体制御を伴いながら温和な条件下で速やかに進行している。酵素が優れた触媒である主な要因は、長い年月の進化を経て最適化された活性中心と、その周辺近傍の精密な分子構造が形成する反応場を有することにある。したがって、我々が新しい触媒を構築する際には、酵素の精巧な反応場を学ぶことが極めて有意義といえる。このコンセプトをもとに、本研究ではタンパク質の空孔に非天然金属錯体を挿入した新しい反応場を構築し、天然の金属錯体の活性を凌駕する人工生体触媒の構築や、天然では見られない有機反応を触媒する新しい金属酵素の開発を実施することが目的としている。
当該年度も、生体内で酸素貯蔵タンパク質として機能するミオグロビンに着目した。このタンパク質は、ヘム分子が補因子として結合し、酸素分子の結合と脱離をつかさどっている。今回は、平成２９年度から精力的に実施しているマンガンポルフィセン錯体を補因子に有する再構成ミオグロビンの、水酸化触媒活性の評価を中心に実施した。以下に得られた実績の概要を示す。
（１）前年度までは、補因子としてマンガンポルフィセンを有する再構成ミオグロビンについて、エチルベンゼン、トルエン、シクロヘキサンの触媒的水酸化反応を中心に行い、またその活性種の議論を行った。今回は、さらに基質として、より分子量の小さい（難易度の高い）ヘキサン、プロパン、エタンへと展開した。
（２）エチルベンゼンを基質として、生成物のアルコールの立体選択性の評価を行った。天然のミオグロビンを用いた場合には、低いエナンチオ選択性しか得られなかったが、ヘムポケット内のアミノ酸残基の変異置換を施すことによって、高いエナンチオ選択性が獲得された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
（１）補因子ヘムをマンガンポルフィセン錯体に置換した再構成ミオグロビンを用いた、幾つかのアルカン基質の触媒的水酸化の活性評価と中間体の同定は、ほぼ前年度までに終了したが、さらに難易度の高い不活性アルカンの水酸化はこれまで達成できなかった。そこで、次の手段として、ヘムポケット内の幾つかのアミノ酸に変異導入を施した変異体を作り、天然のヘムをマンガンポルフィセンと置換した再構成ミオグロビン変異体を調製した。その結果、幾つかの変異体では、ヘキサンやプロパンの触媒的水酸化がスムーズに進行し、生成物として２級のヘキサノールやプロパノールが、過酸化水素存在下で得られた。具体的には、ヘムポケットに存在するHis64をAlaに変換することにより、顕著に酵素活性が向上することが明らかとなった。さらに、Phe43を小さな疎水的アミノ酸（たとえばVal, Ile, Leu ）に変換することによっても、活性が上昇した。これらは、基質のヘムポケットへの結合に寄与していると考えられる。さらにダブル変異体（たとえばH64A/F43VやH64A/F43I）などでは、プロパンの場合、TONが２５から３０程度まで上昇した。
（２）生成物の立体選択性については、エチルベンゼンの水酸化による生成物の2―ヒドロキシエチルベンゼンのS体とR体をキラルカラムを用いた解析により議論した。天然のヘムポケットを有する再構成ミオグロビンでは、S体が14%eeであったが、H64A変異体を用いた際にはR体で43%ee、さらにダブル変異体であるF43L/H64Aでは、R体が57%ee、トリプル変異体のF43A/H64I/V68FではS体が69%eeまで向上した。このように、ヘムポケットの構造をチューニングすることにより、生成物の立体選択性が制御できることを示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本来は酵素としての活性をほとんど示さないミオグロビンを利用して、難易度の高い反応をつかさどる酵素に変換することは、非常に挑戦的な課題である。これまでに、ミオグロビンの補因子であるヘム（鉄ポルフィリン錯体）を、非天然の金属錯体に置換することによって、得られた再構成タンパク質は、時に天然のミオグロビンを凌駕する活性や、天然には見られない触媒反応をつかさどる新しい人工金属酵素として働くことを示してきた。近年は、高難度なアルカンの水酸化反応について焦点をあて、これまで、プロパンの水酸化まで達成することが可能となった。今後の推進方策としては、エタンおよびメタンを基質とした水酸化反応が一つのターゲットとなる。エタンおよびメタンは、非常にC-H結合のBDE値が大きく、水酸化反応は困難であると共に、水への溶解度も低く、これらの問題の解決がポイントとなる。まずはこれまで試みてきた変異体による活性の評価と共に、補因子側もさらに活性の高い錯体を求め、ポルフィセン環の側鎖に置換基を導入することも検討したい。さらに基質の溶解度を向上させるための条件検討（反応溶液の塩濃度や加圧条件での反応、反応温度、有機溶媒の混合など）の吟味を行う予定である。
もう一つ、本研究の総括として、構造と反応性の相関を議論したい。これまで高活性が得られてきた変異体の反応場の構造については、MD計算から見積ることを主に行っていたが、やはりX線結晶構造解析から構造を明らかにし、ヘムポケットの構造と活性の相関を十分に検討することが必要であると考えている。したがって、活性の高い変異体にマンガンポルフィセン錯体を挿入し、結晶化を試み、構造解析に着手する予定である。ここから得られる知見は、さらなる酵素活性の向上や、立体選択性の制御に有益な知見が得られるものと期待される。
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