2015 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Discovery of the logic that establishes the 3D structure of organisms |
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| Project/Area Number |
15H05864
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
近藤 滋 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (10252503)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
後藤 寛貴 名古屋大学, 生命農学研究科, 特任助教 (60737899)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 成虫原基 / 細胞シート / 折り畳み / ３Ｄ形態 / シミュレーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度の研究状況は以下の通りです。
１：３Ｄデータ取得のための手法の改善 研究開始時点に撮ったマイクロＣＴ画像では、３Ｄ折り畳みの詳細、特に内側の部分の解像度が悪く、正確な３Ｄ構造を再現できていなかった。そのため２つの方法で改善を試みた。一つ目は造影剤により細胞シートを際立たせる方法で、これは、簡便な上に、かなり正確なデータｇ得られる。しかし、薬剤処理の過程で、内部の皺が接着し生体における形とは異なるという欠点もある。次に、凍結切片の連続画像を画像解析ソフトで再構成する方法であるが、これは、生きた状態をほぼ再現できることが判った。今後、この２つのやり方の組み合わせて研究を進めていく。
２：遺伝子ノックダウンによる奇形角の作成 皺の成長時、および奇形を起こした角の折り畳みと３Ｄ形態を比較するために、成長過程の異なる原基や、奇形を誘発するmicroＲＮＡを注入した蛹と幼虫を多数作成した。順次上記の方法で３Ｄ形態を観察する。
３：皺の微細構造と成長 平行して、皺がどの様に成長するかについて、細胞レベルの観察を行っている。皺の折り畳まれた部分と平面部分の細胞分裂頻度を比較した結果、皺は、凸と凹の両方の先端で細胞分裂が盛んになっていることが判った
４：皺のできる原理についての考察 ３Ｄバーテックスモデルを使い、皺のできる過程に関する初歩的なシミュレーションを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、３Ｄデータ取得法の改善とデータ取得のためのサンプルの蓄積が主な目的であり、その目的は達したと考えている。２種類の方法（マイクロＣＴとクライオ切片の連続像からの再構成）により、おおよその、折り畳み形成過程は把握できるようになった。また、外殻との相互作用の重要性も、形態変化から明らかになっている。今後は、領域を細分化して、さらに細かい領域での詳細な折り畳み過程を観察して行く。また、初歩的ではあるが、バーテックスモデルを利用して、折り畳みのおおよその変化を再現できるようになったことも重要である。外殻との接着領域をモデル上で設定すると、それに応じて、大まかな折り畳み過程を再現できる。今後、このモデルに、さらに細かい折り畳みの状況が再現できるようにできれば、ゴールに近づけると考える。一方で、カブトムシには、ショウジョウバエのようにサンプル数を自由に増やせないというデメリットがある。春に、大量に幼虫を仕入れても、冬を越すと、蛹化が起きにくくなり、実験ができない。今後、RNAiの方法により、遺伝子ノックダウンによる形態の変化のデータを取得して行く際に、これが問題になると思われ、解決法を探している。今のところ、飼育温度の改変などを試みているものの、まだ、結果は出ていおらず、この点がやや気がかりである。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験：今年は、成長過程の異なる原基や、奇形を誘発するmicroＲＮＡを注入した個体の角原基の３Ｄ形態の観察を集中的に行い、３Ｄ形態形成原理の解明に迫っていきたい。奇形を誘発する遺伝子は今のところ２つしか試していないが、公募班員の新美教授との共同研究で、これを５～１０種類に増やし、異なるタイプの形態変異を誘発することで、３Ｄ形態を作るパラメータにはどんな物が有るかを推定する。
また、共同研究者のコスタリカ大学西田賢司氏からは角ゼミの幼虫を固定したものを送っていただくことになっており、ツノゼミ角の３Ｄ形態の観察も行い、カブトムシと比較する。また、西田氏からの情報で、コスタリカのナナフシ類には、卵からの孵化時に、卵の８倍から２０倍の大きさの幼虫が出てくるものがあり、そのいくつかは、彼の飼育施設で維持しているという情報を得ている。孵化直前の卵を取得し、角原基同様の解析を行う予定である。おそらく、同じロジックが使われていると予想される。
シミュレーション：これまでに作ったシミュレーションは、原基細胞膜と外殻との接着領域に依存して、その大まかな形態を決定する物なので、その過程が正しいかどうかの実験をまず行い、それを確認したうえで、次の、より細かい折り畳みの再現に移りたい。
幼虫の活性が冬季に下がる件に関しては、保存温度条件とうの調節を引き続き試みるが、より現実的に、購入する個体を増やすことと、早い時期に集中的に実験を行い、冬季には解析の作業に集中することで乗り切れるのではないかと考えている。
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