2017 Fiscal Year Annual Research Report
膜の疎水領域でのリポクオリティ認識機構とナノ膜ドメインの解明
| Project Area | Quality of lipids in biological systems |
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| Project/Area Number |
15H05901
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡村 康司 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80201987)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中川 敦史 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20188890)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / タンパク質ドメイン / 電位センサー / イノシトールリン脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電位依存性プロトンチャネルHv1について、これまでに構築した全反射照明蛍光顕微鏡を用いてパッチクランプ膜電位固定同時計測下で経時的にHEK2932細胞へ発現させたmCherry-Hv1融合分子の蛍光シグナルを計測し、膜電位依存的な細胞膜表面へのチャネルの組み込みと思われる信号変化を得ることに、成功した。１分子での計測には、今後発現密度を適度に落とす方策が必要であるが、stop コドンの下流に蛍光分子のコード領域をいれて、低比率でのリードスルーの効果を用いる手法などを活用することで、今後、単一分子レベルでの解析を目指す予定である。
電位依存性ホスファターゼCi-VSPについては、フォトマルを用いた電位センサーの動きをVoltage clamp fluorometry法で、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて計測し、酵素領域の動きを非天然アミノ酸Anapのアンバーサプレッサー遺伝学導入手法を用いて定量した結果、酵素ドメイン中にVSP間で保存されているhydrophobic spineは、酵素活性の調節と、電位センサーから酵素活性へのカップリングの両方に増強作用があることを見出した。電位センサーの具体的などのような構造変化がhydrophobic spineを介して酵素活性を活性化するのかの詳細は未だ不明であり、今後の検討が必要であるが、複数の酵素の構造変化の段階依存的に、hydrophobic spineと膜との相互作用が異なる役割を担うと結論した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Anapの蛍光変化の生物物理学的特性を明らかにする解析については、スペクトロフォトメーターを装着したセットの構築を終え、膜電位固定下で波長スペクトル特性の計測に成功した。
VSP全長蛋白と基質との共結晶化について複数のコンストラクトから質の良いタンパク質のコンストラクトを得ることに成功し結晶化スクリーニングを行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在得られているコンストラクトの発現精製条件の更なる検討を行い、VSPと基質との共結晶化を更にすすめ、基質のリポクオリティ認識機構の解明を目指す。
Hydrophobic spineについて、VCFとAnap蛍光計測と電気生理を組み合わせた解析を進め、電位センサーの構造変化との関係を明らかにすると共に、構造生物学側の解析では分解能の高い構造解析を目指し、膜との相互作用の分子機構に迫る。
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Research Products
(71 results)
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[Presentation] A new mechanism of Ca2+-independent voltage-dependent secretion in dorsal root ganglion neurons2019
Author(s)
Zhuan Zhou, Yuan Wang, Hiroki Arima, Rong Huang, Yuqi Hang, Xingyu Du, Feipeng Zhu, Zuying Chai, Changhe Wang, Yasushi Okamura
Organizer
The 9th Federation of the Asian and Oceanian Physiological Societies Congress (FAOPS2019) , 第96回日本生理学会年会 合同大会
Int'l Joint Research / Invited
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[Presentation] Functional analysis of voltage-sensing phosphatase in mouse sperm2019
Author(s)
Takafumi Kawai, Haruhiko Miyata, Hiroki Nakanishi, Souhei Sakata, Yoshifumi Okochi, Masahiko Watanabe, Kenji Sakimura, Takehiko Sasaki, Masahito Ikawa, Yasushi Okamura
Organizer
The 9th Federation of the Asian and Oceanian Physiological Societies Congress (FAOPS2019) , 第96回日本生理学会年会 合同大会
Int'l Joint Research / Invited
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[Presentation] Development of a chemiluminescent voltage indicator applicable to brain activity recording in freely moving multiple mice2017
Author(s)
Shigenori Inagaki, Masakazu Agetsuma, Hidekazu Tsutsui, Shinya Ohara, Yoshiyuki Arai, Kazushi Suzuki, Yuka Jinno, Tomoki Matsuda, Toshio Iijima, Yasushi Okamura, Takeharu Nagai
Organizer
第40回日本神経科学大会
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[Presentation] Molecular dynamics study of kinetics of the voltage-gated proton channel VSOP/Hv1 under electric fields2017
Author(s)
Hiroko X. Kondo, Yasushige Yonezawa, Naoyuki Miyashita, Masayo Iwaki, Kohei Takeshita, Yuichiro Fujiwara, Matsuyuki Shirota, Kengo Kinoshita, Yasushi Okamura, Atsushi Nakagawa, Hideki Kandori, Yu Takano
Organizer
第55回日本生物物理学会年会
Invited
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