2015 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内外における局所温度の最先端計測技術の開発と実践
| Project Area | Integrative understanding of biological phenomena with temperature as a key theme |
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15H05931
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
原田 慶恵 京都大学, 物質－細胞統合システム拠点, 教授 (10202269)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡部 弘基 東京大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (20455398)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | バイオイメージング / 細胞構造・機能 / 細胞内温度計測 / 蛍光寿命イメージング / 蛍光性温度センサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、これまでに発見した細胞内局所温度変化の生成機構の理解と生理的意義を解明することを目的としている。これを達成するために、神経細胞を含む種々の細胞内の温度分布を定量的に観察するシステムや細胞内の局所を人工的に加熱する実験系の構築と最適化に取りくんだ。さらに、領域内共同研究として、構築したシステムを用いて各種神経細胞内への温度センサーの導入と蛍光寿命イメージングによる検出を行った。一方、細胞内の局所加熱技術の開発としては、ガラス上に集光させた赤外（IR）レーザー照射や細胞表面に配置した金ナノ粒子へのレーザー光照射による加熱法を検討した。これらを用いて、実際に細胞内局所加熱が行えることを確認した。
また、細胞内局所発熱が細胞機能に与える影響を検証するため、発熱と関連のある現象としてストレス時の細胞内RNA顆粒形成に着目し、ストレス時の細胞内温度の計測や細胞内の局所加熱によるRNA顆粒形成を検討した。
更に、領域内共同研究を進めるために、遺伝子特異的温度変動の可視化を行う実験系のセットアップや概日リズムのイメージングシステムの導入を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通り細胞内温度の定量的測定および局所加熱システムの構築を行った。これまでに開発したアクリルアミド性ポリマー温度センサーを生細胞内にマイクロインジェクション法により導入する方法に加え、多数の細胞の温度を網羅的に計測するために、細胞膜透過型温度センサーを導入し、細胞内温度を検出する方法を確立した。COS7細胞やHeLa細胞に導入する際の条件（センサー濃度、インキュベート時間、溶媒濃度）を最適化した。細胞内の温度センサーの蛍光を高感度かつ選択的に検出するには蛍光寿命を指標に検出することが有効である。そこで、パルスレーザーにより蛍光色素を励起し、各ピクセルの光子数の時間変化を記録し、得られた減衰曲線の近似により決定した蛍光寿命を再構築することで蛍光寿命像を取得することができる、レーザー走査型共焦点顕微鏡に単一光子計測法（TCSPC）を連結した蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）を新たに整備した。
また、神経細胞における色素を温度計測法確立に向けて、モデル神経細胞であるPC12の培養系および分化誘導系にマイクロインジェクションにより温度センサーを導入する実験系を確立した。開発した方法により、分化前後のPC12細胞内の温度分布をイメージングすることに成功した。
さらに、細胞内の局所を加熱する方法の開発と応用にも取り組んだ。1500 nm程度の赤外（IR）レーザーは細胞内の水分子を直接加熱することができる。そこで、細胞内温度イメージングが可能なFLIMにIRレーザーを導入し、ガラス上にて集光させるIR-Legoシステムを構築した。これを用いてIRレーザー照射時の細胞内温度イメージングを行ったところ、細胞内局所を定量的に加熱出来ることを確認した。また、細胞内温度の実時間イメージングと組み合わせて、一過的加熱を追跡することにより、細胞内における熱の拡散を詳細に観察した。
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光性温度センサーの定量的イメージングを用いた方法の改良や拡張により、神経細胞における温度計測法、異なる細胞間における細胞内温度の比較法の開発を進める。次に、これらを用いて神経細胞内において分化が細胞内温度分布に及ぼす影響を解析する。さらに、細胞内発熱や温度勾配形成の分子機構を解明するため、特定遺伝子抑制時の温度計測法の開発と応用を行う。なお、これら温度計測法の開発と応用では、各種神経細胞の調製と機能との関連の解明（柴崎との連携）、核・細胞質における温度センシング機構の解明（今本との連携）や、種々の代謝条件にある恒温哺乳類細胞や変温生物細胞での温度計測（梅田との連携）と協調して進める。
次に、細胞内温度変化に対する細胞応答を検討するために、細胞内温度の操作法の開発と応用を行う。これまでに開発した赤外レーザーを用いた細胞内局所加熱法を用いて、ストレス時培養細胞内におけるRNA 顆粒形成機構の解明を行う。また、金ナノ粒子のレーザー光照射による特定の細胞や細胞内における分子選択的な加熱法の開発に取りくむ。さらに、細胞内の膜表面や特定の細胞小器官の加熱法を行うことにより、形質膜の局所温度操作によるTRP チャネルの活性化と形質膜温度計測（富永との連携）や、温度変化依存的代謝制御（梅田との連携）へ応用する。
神経細胞および脳スライス組織における温度計測技術の開発を進める。さらに、土居と連携して視交叉上核の時計ニューロンにおける細胞内温度分布とその時間変動計測へと応用する。自発性概日変動と細胞内温度分布との関連を調べるとともに、外因性刺激による時刻位相の変化に対する細胞内温度の応答を解析する。
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[Journal Article] ECHO-liveFISH: in vivo RNA labeling reveals dynamic regulation of nuclear RNA foci in living tissues.2015
Author(s)
Oomoto I, Suzuki-Hirano A, Umeshima H, Han YW, Yanagisawa H, Carlton P, Harada Y, Kengaku M, Okamoto A, Shimogori T, Wang DO
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Journal Title
Nucleic Acids Res.
Volume: 43
Pages: e126
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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