2015 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Chromosome Orchestration System |
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| Project/Area Number |
15H05974
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岩崎 博史 東京工業大学, 大学院生命理工学研究科, 教授 (60232659)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | DNA 二重鎖切断 / DNA修復 / 相同組換え / 接合型変換 / 分裂酵母 / Rad51リコンビナーゼ / 遺伝情報維持 / DNA鎖交換反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAの二重鎖切断（DNA double strand break; DSB）は、細胞にとって最も危機的なDNA損傷の一つである。DSBの修復には相同組換えが主要なDNA修復機構の一つとして機能する。本計画では、DSBが導入された染色体はいかなるメカニズムによってDSB修復を実現しているのか、染色体の時空間制御機構解析、組換え反応の試験管内再構成系、さらに、リアルタイム解析・１分子解析などによって多面的に切り込み、且つ、接合型変換をモデル系として4D情報を解析することで、DSB修復装置が核内でどのように時空間を制御して作動するのか、分子基盤や基本原理を明らかにしようとしている。特に、申請者が発見した相同組換え因子を主軸に、分裂酵母をモデル系としてDSB の修復過程における染色体の３Ｄ・４Ｄダイナミズムを明らかにしようとするもので、当該年度は次の実績をあげた。
（１）相同組換えによるDNA二重鎖切断修復の3D 構築解析として、蛍光偏光解消法や蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) を用いて、Rad51 presynaptic フィラメント形成とDNA鎖交換反応のリアルタイム解析を行った。とくに、FRETを用いたリアルタイムアッセイ系から、予備的ながら、DNA鎖交換反応が3ステップで進行することを示唆する証拠を得た。
（２）分裂酵母の接合型変換におけるドナーDNAの選択機構をモデル系として、組換えにおける染色体の時空間制御、すなわち、4D情報を解析する。該当年度は、3C解析の精度を上げることに成功し、より詳細なmat 領域の染色体空間配置を解析した。また、欠失ライブラリーを作成して、接合型変換に関与する遺伝子の網羅的解析を行い、約8割の非必須遺伝子欠失変異体の表現型を解析し、接合型変換に異常があるものを特定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
27年度計画として、i）蛍光偏光解消法や蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) を用いて、Rad51 presynaptic フィラメント形成とDNA鎖交換反応のリアルタイム解析を行う。ii）接合型変換をモデル系として、DNA組換え反応の試験管内再構成系の構築し解析する。iii)分裂酵母の接合型変換におけるドナーDNAの選択機構をモデル系として組換えにおける染色体の時空間制御を解明する、などを計画し実施してきた。このなかで、FRETを用いたDNA鎖交換反応のアッセイ系については、特段の進捗を遂げることができたと考えている。すなわち、DNA strand displacement (DSD) アッセイとDNA strand pairing (DSP) アッセイを確立して、リアルタイムでDNA鎖交換をモニターすることに成功した。これを用いて、反応速度論についてシミュレーションを行い、この反応が、２つの反応中間体を通る3ステップで進行する証拠を得ることができた。また、Rad51が持つATPase活性について、それがどのステップに関係するかを解析し、最初のペアリングには、ATPの加水分解は必要でないことを示すことができた。また、分裂酵母の接合型変換の解析では、3C解析の精度を上げることに成功し、より詳細なmat 領域の染色体空間配置を解析した。また、欠失ライブラリーを作成して、接合型変換に関与する遺伝子の網羅的解析を行い、新しく接合型変換に関与する遺伝子候補を多数同定した。今後は、遺伝解析によって、接合型変換のどのステップに欠損があるのか、詳細に解析していきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）FRETを用いたリアルタイムのDNA鎖交換反応解析について、Swi5-Sfr1ヘテロ二量体の効果、カルシウムイオンの効果などを解析し、なるべく早いうちに、論文として発表したい。また、これまでに、多数のRad51変異株を分離し、また変異タンパク質を精製し、遺伝学的解析や生化学的解析を行ってきた。これらミュータントについて、今回確立したFRETを用いたリアルタイムアッセイを行い、これらミュータントにおいて反応のどのステップに欠損があるのかを解析する。また、もう一つのRad51活性化因子であるRad55-Rad57の生化学的解析が可能となったので、同様に、FRETを用いたリアルタイムのDNA鎖交換反応解析を行う。また、ヒトのRad51とその関連因子も精製したので、これらについても、リアルタイムアッセイを行う。
２）接合型変換遺伝子の網羅的解析を完成させ、論文に纏める。また、mat座におけるSwi2の局在については、新しくアッセイ方法を開発したので、これを用いて、再度、詳細に解析する。また、同調細胞を用いて時間分解能をあげることを早急に確立する。野生型におけるSwi2の局在パターンについて、決定的な証拠を得たあと、早急にSwi6やChp2など、mat座のクロマチン構造関連因子の影響を解析する。
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