2015 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Chromosome Orchestration System |
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| Project/Area Number |
15H05975
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
荒木 弘之 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 教授 (20151160)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | DNA複製 / in vitro系 / クロマチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝情報を担う染色体では様々な反応が調和して起こることにより、染色体が安定に維持され、倍加し、娘細胞へと分配されていく。しかしその詳細は未だ分からない部分が多く、染色体がその構造を維持しながらどのように倍加して行くのか、そして他の染色体動態とどのように連携するのかを解明することを本研究の目的としている。この目的を達成するため主として出芽酵母のin vitro DNA複製系を用いるが、最近報告されたばかりで、複製効率が低く、今後の解析には十分な改良を施す必要がある。そのため本研究期間においては、複製系の確立とそれを用いた解析を行った。
まず、精製タンパク質から効率のよい複製反応を再構成するため、必要なタンパク質の精製を行った。当初、DNAヘリカーゼコアであるMcm2-7の複製開始領域へのローディング効率が悪かったが、精製法を工夫することにより改善することができた。そして、DNA上にローディングしたMcm2-7を原子間力顕微鏡で観察し、その像からこれまでのローディングモデルの修正を提案している。また、DNAポリメラーゼα、δ、εについても精製しDNA合成反応を可能としている。特に、DNAポリメラーゼαについては、十分量の精製に時間を要したが、発現法と精製法を工夫することにより、解析に必要な量を確保できるようになった。
さらにMcm2-7を含む活性型ヘリカーゼであるCdc45-Mcm2-7-GINS (CMG)複合体を精製するとともに、このヘリカーゼ活性を簡単に測定できる系も確立した。この系を用いて、クロマチンDNAと裸のDNAのヘリカーゼの働き方を比較したが、短いDNAを用いる限り大きな違いはないことが分かった。今後、種々のクロマチンDNAについて同様の解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究期間においては、効率的複製を行うための因子について、DNAポリメラーゼαとMcm2-7において、その精製が遅れたが現在は既に追いついている。一方で、当初予定より早く、クロマチン構造とヘリカーゼの関係の研究を開始することができた。従って、全体では順調であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
活性ヘリカーゼを用いた系を立ち上げることができたが、驚くことにクロマチンは大きな影響を与えなかった。そこで、より積極的に複製フォークを停止させる系を用いて、解析を進めていく予定である。
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[Journal Article] New insights into the GINS complex explain the cntroversy between existing structural models.2017
Author(s)
Carroni, M., March, M. D., Medagli, B., Krastanova, I., Taylor I. A., Amenitsch, H., Araki, H., Pisani, F. M., Patwardhan, A. and Onesti, S.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 7
Pages: 40188
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Biochemical analysis of the pausing of the eukaryotic replicative helices, CMG complex2016
Author(s)
HIZUME, Kohji, Endo, Shizuko, Muramatsu, Ikuko, Kobayashi, Takehiko, ARAKI Hiroyuki
Organizer
10th 3R International Symposium
Place of Presentation
Matsue, Japan
Year and Date
2016-11-13 – 2016-11-17
Int'l Joint Research
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