2017 Fiscal Year Annual Research Report
Biosynthetic redesign of small molecules aimed for the concurrent improvements of cell permeability and water solubility
| Project Area | Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries |
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16H06445
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
濱野 吉十 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50372834)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山中 一也 関西大学, 化学生命工学部, 准教授 (30756870)
丸山 千登勢 福井県立大学, 生物資源学部, 講師 (20452120)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 生体膜透過性 / ポリカチオン / アミノ酸ポリマー / 生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ポリカチオン性化合物は、高極性でありながら高い生体膜透過性も併せ持つことが知られている。そこで本研究では、「①生体膜透過性・水溶性に問題がある既存薬物」、「②微生物未利用遺伝子から創出する新規機能性低分子」の2種の低分子化合物について、ポリカチオン化修飾による生体膜透過性と水溶性の一挙改善を目指す。本研究の目的達成のために、研究項目A、研究項目B、研究項目Cの計3つの研究項目を毎年度行なっている。
平成29年度は、クリック官能基をoligo(β-Lys)にアミド結合で導入するOrf19を用いた酵素法を確立した（研究項目A）。さらに、抗真菌抗生物質であるアムフォテリシンB （AmpB）をポリカチオン修飾し、抗真菌活性を維持させながら高い水溶性を付与できることを確認した（研究項目C）。微生物ゲノムマイニングによって、新規ポリカチオンポリマーとしてε-ポリ-β-リジン、およびD体ポリカチオンポリマーとしてγ-ポリ-D-ジアミノブタン酸を同定した（研究項目B）。βホモリジンを含有するレゾルマイシンの生合成遺伝子群を同定し、各遺伝子および生合成酵素の機能解析を進めている（研究項目B）。微生物ゲノムマイニングと生合成遺伝子群の機能解析によって、新規機能性低分子（新規ストレプトスリシン類縁抗生物質）を創製した（研究項目B）。ポリカチオン修飾する機能性低分子としては、既存薬物以外に、微生物未利用遺伝子から創出する新規機能性低分子をターゲットにしている。そこで、本研究に必須な技術であるin vivoクローニングを基盤とした異種発現システムの構築を行った（研究項目B）。さらに、物理化学的な生体膜透過性の評価法を確立するために、電気分析法の基本技術を開拓した（研究項目C）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【研究項目A】クリック官能基をε-PLへ導入する微生物変換法を確立しているが、精製過程においてエステル結合が切断されクリック官能基が脱離する問題があった。そこで、種々検討したところ、PEGをリンカーに有するクリック官能基は比較的安定であることを見出し、特許出願した（特願2017-159848および特願2017-159849）。また、培養液からクリック官能基を有するε-PLを簡便に生成する手法を確立した。クリック官能基をoligo(β-Lys)にアミド結合で導入するOrf19を用いた酵素法を確立しており、現在、酵素反応条件の最適化を進めており、収率の向上を目指している。
【研究項目B】微生物ゲノムマイニングによって、新規ポリカチオンポリマーとしてε-ポリ-β-リジン、およびD体ポリカチオンポリマーとしてγ-ポリ-D-ジアミノブタン酸を同定した。βホモリジンを含有するレゾルマイシンの生合成遺伝子群を同定し、各遺伝子および生合成酵素の機能解析を進めている。微生物ゲノムマイニングと生合成遺伝子群の機能解析によって、新規機能性低分子（新規ストレプトスリシン類縁抗生物質）を創製した。
【研究項目C】抗真菌抗生物質であるアムフォテリシンB （AmpB）は、深存性真菌症の治療薬として臨床上極めて重要な医薬品であるが、ほとんど腸管吸収されないため主に注射剤として使用される。しかし、難水溶性のため注射剤としての製剤調製が難しく、腎毒性、長期静注投与などの問題点もある。そこで、AmpBをε-PL修飾したところ、興味深いことに抗真菌活性を維持させながら高い水溶性を付与することができた。
以上、研究項目全体としては、当初の計画通りに進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
【研究項目A：ポリリジン不飽和アルコールエステルによる機能性低分子のポリカチオン化修飾】ペプチド鎖長が異なるε-PLにクリック官能基を導入し、ポリカチオン化修飾のツールを拡充する。また、新規ポリカチオンポリマーであるε-ポリ-β-リジンへのクリック官能基を導入する培養条件を検討する。Orf19によるoligo(β-Lys)-PEG-azideの酵素合成反応条件を最適化し、さらにその精製条件を検討する。
【研究項目B：微生物ゲノムマイニングによる新規ポリカチオン化合物の探索および新規機能性低分子の創製】研究分担者の山中は、酵母のin vivo相同組換え能を利用したTransformation-Associated-Recombination（TAR）と呼ばれる手法を応用し、研究対象とする長大な二次代謝産物生合成遺伝子群をゲノムライブラリーの構築を経ることなく微生物ゲノムから直接かつ過不足なくベクターへクローン化し、異種発現宿主へ移植する手法を開発している。そこで、このTAR法をさらに効率化し、生合成遺伝子クラスターのクローニングと異種発現系を効率化する。
レゾルマイシンの生合成遺伝子群をクローニングし、異種発現によりレゾルマイシン大量調製を試みる。
【研究項目C：ポリカチオン化機能低分子の細胞膜透過性および機能発現評価】既存薬物として、ドキソルビシン、バンコマイシンなどをε-PLによるポリカチオン修飾を行い、動物細胞内への取り込みを評価する。現在、動物細胞としてHeLa細胞のみを使用しているが、HEK293細胞などにおいても同様の結果が得られるか検証する。
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[Journal Article] Partition of amines and lysine oligomers between organic solvent and water under a controlled interfacial potential difference2018
Author(s)
Katano, H., Maruyama, M., Kuroda, Y., Uematsu, K., Maruyama, C., Hamano, Y.
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Journal Title
J. Electroanal. Chem.
Volume: 820
Pages: 97-102
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Promotion effect of streptothricin on a glucose oxidase enzymatic reaction and its application to a colorimetric assay2018
Author(s)
Uematsu, K., Ueno, T., Kawasaki, H., Maruyama, C., Hamano, Y., Katano, H.
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Journal Title
Anal. Sci.
Volume: 34
Pages: 143-148
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Functional analysis of methyltransferases participating in streptothricin-related antibiotic biosynthesis2018
Author(s)
Niikura, N., Maruyama, C., Ogasawara, Y., Shin-ya, K., Dairi, T., Hamano, Y.
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Journal Title
J. Biosci. Bioeng.
Volume: 125
Pages: 148-154
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Imaging mass spectrometry analysis of ubiquinol localization in the mouse brain following shortterm administration2017
Author(s)
Tatsuta, T., Kasai, K., Maruyama, C., Hamano, Y., Matsuo, K., Katano, H., Taira, S.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 7
Pages: 12990
DOI
Peer Reviewed
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