2019 Fiscal Year Annual Research Report
Biosynthetic redesign of small molecules aimed for the concurrent improvements of cell permeability and water solubility
| Project Area | Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries |
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| Project/Area Number |
16H06445
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
濱野 吉十 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50372834)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山中 一也 関西大学, 化学生命工学部, 准教授 (30756870)
丸山 千登勢 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (20452120)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞膜透過性 / cell penetrating peptide / ポリカチオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ポリカチオン性化合物は、高極性でありながら高い生体膜透過性も併せ持つことが知られている。そこで本研究では、「①生体膜透過性・水溶性に問題がある既存薬物」、「②微生物未利用遺伝子から創出する新規機能性低分子」の2種の低分子化合物について、ポリカチオン化修飾による生体膜透過性と水溶性の一挙改善を目指す。本研究の目的達成のために、研究項目A、研究項目B、研究項目Cの計3つの研究項目を毎年度行なっている。
令和元年度は、ε-PLへthiol基を導入することを目的に、thioglycerolの導入効率を改善した。また、Orf19によるoligo(β-Lys)-PEG-azideの酵素合成反応条件を確立した。（研究項目A）。新規ポリカチオンポリマーとしてε-ポリ-β-リジン、およびD体ポリカチオンポリマーとしてγ-ポリ-D-ジアミノブタン酸を同定した。また、γ-ポリ-D-ジアミノブタン酸の生合成機構を解明した。新規機能性低分子の創製においては、メチルシクロプロパンの新規生合成酵素を同定し機能解析した。βホモリジンを含有するレゾルマイシンの生合成研究においては、生合成遺伝子群を同定するとともに各遺伝子および生合成酵素の機能解析を進めている（研究項目B）。Orf19を利用したoligo(β-Lys)-PEG-azideの酵素合成法を確立している。そこで、oligo(β-Lys)-PEG-azideを用いて、FAMをoligo(β-Lys)修飾し細胞膜透過性を検証した。その結果、HeLa細胞において顕著な細胞膜透過性を観察し、また、エンドサイトーシスおよび受動拡散の両機構によって細胞内に取り込まれることを明らかにした。興味深いことに核内にも局在していることを見出した
以上、研究項目全体としては、当初計画した実験手法に若干の修正を加えながら最終目標に向けて順調に進展している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【研究項目A：ポリリジン不飽和アルコールエステルによる機能性低分子のポリカチオン化修飾】azide基、alkyne基、thiol基などのクリック官能基をε-PLに導入する微生物変換法を確立しているが、thiol基については変換効率を改善する余地が残っていた。そこで、培養条件を再検討し、ε-PLへthioglycerolを導入する効率を改善した。また、Orf19によるoligo(β-Lys)-PEG-azideの酵素合成反応条件を確立した。
【研究項目B：微生物ゲノムマイニングによる新規ポリカチオン化合物の探索および新規機能性低分子の創製】微生物ゲノムマイニングによって、新規ポリカチオンポリマーとしてε-ポリ-β-リジン、およびD体ポリカチオンポリマーとしてγ-ポリ-D-ジアミノブタン酸を同定した。また、γ-ポリ-D-ジアミノブタン酸の生合成機構を解明した。新規機能性低分子の創製においては、メチルシクロプロパンの新規生合成酵素を同定し機能解析した。βホモリジンを含有するレゾルマイシンの生合成研究においては、生合成遺伝子群を同定するとともに各遺伝子および生合成酵素の機能解析を進めている。
【研究項目C】Orf19を利用したoligo(β-Lys)-PEG-azideの酵素合成法を確立している。そこで、oligo(β-Lys)-PEG-azideを用いて、FAMをoligo(β-Lys)修飾し細胞膜透過性を検証した。その結果、HeLa細胞において顕著な細胞膜透過性を観察し、また、エンドサイトーシスおよび受動拡散の両機構によって細胞内に取り込まれることを明らかにした。興味深いことに核内にも局在していることを見出した
以上、研究項目全体としては、当初計画した実験手法に若干の修正を加えながら最終目標に向けて順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
【研究項目A：ポリリジン不飽和アルコールエステルによる機能性低分子のポリカチオン化修飾】分子標的に特異的に結合し、高分子医薬よりも分子量が小さい中分子ペプチドは、次世代医薬としての期待度が高い。しかし、分子量1000を超える中分子ペプチドの多くは細胞膜透過性が低く、生理活性を示さないものも多い。そこで、ε-PL-PEG-azideあるいはoligo(β-Lys)-PEG-azideを用いて中分子ペプチドをポリカチオン修飾することで細胞膜透過性を付与できるか検証する。
【研究項目B：微生物ゲノムマイニングによる新規ポリカチオン化合物の探索および新規機能性低分子の創製】βホモリジンを含有するレゾルマイシンの生合成研究においては、生合成遺伝子群を同定しており、各遺伝子および生合成酵素の機能解析を進めている。βホモリジンは、Orf19の基質として利用され、oligo(β-homoLys)を合成できることから、新しいポリカチオン修飾ツールとして利用が期待される。そこで、βホモリジンの生合成機構を解明し、βホモリジンの微生物生産に挑戦する。昨年度の研究で同定した新規ポリカチオンポリマーであるε-ポリ-β-リジンの高生産培養を検討し、ε-ポリ-β-リジンからのβ-リジン調製を検討する。
【研究項目C：ポリカチオン化機能低分子の細胞膜透過性および機能発現評価】ε-PL-PEG-azideあるいはoligo(β-Lys)-PEG-azideでポリカチオン修飾したダプトマイシン、バシトラシン、ナイシンについて細胞膜透過性を検証し、細胞毒性を評価する。細胞毒性を示した場合には、その分子標的を同定する。ポリカチオン修飾したダプトマイシン、バシトラシン、ナイシンは固相カラムに固定化することが可能であり、このアフィニティーカラムを利用して分子標的を捕捉し、LCMSにて同定する。
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[Journal Article] C-Methylation of S-adenosyl-L-Methionine Occurs Prior to Cyclopropanation in the Biosynthesis of 1-Amino-2-Methylcyclopropanecarboxylic Acid (Norcoronamic Acid) in a Bacterium2020
Author(s)
Chitose Maruyama, Yukiko Chinone, Shusuke Sato, Fumitaka Kudo, Kosuke Ohsawa, Junya Kubota, Junko Hashimoto, Ikuko Kozone, Takayuki Doi, Kazuo Shin-Ya, Tadashi Eguchi, and Yoshimitsu Hamano
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Journal Title
Biomolecules
Volume: 10
Pages: E775
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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