2016 Fiscal Year Annual Research Report
ポリケタイド関連化合物の生合成系リデザインによる新規生体機能分子の創製
| Project Area | Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries |
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| Project/Area Number |
16H06446
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
南 篤志 北海道大学, 理学研究院, 准教授 (40507191)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 天然物化学 / 生合成 / 酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、ポリケタイド系天然物の生合成マシナリーをリデザインして潜在的生物活性ポリケタイドを創製することを目的とする。具体的には、①数ある天然物生合成酵素の機能解析の中でも最難関の課題の一つとして位置づけられている骨格構築酵素PKS(-NRPS)の反応制御機構の解明と自在な機能制御、②修飾酵素の精密機能解析とそれを利用したポリケタイド鎖の構造多様化、③生合成システムの人為的再構築による複雑骨格多官能性分子の酵素合成の実現に取り組む。本年度は主に①と②について検討した。
骨格構築酵素を構成する複数の機能単位（＝ドメイン）によって触媒される多段階反応を明らかにするための第一段階として、PKS-NRPSの末端に位置する切り出しドメインに着目したドメイン交換実験を行った。連結部位が酵素活性に与える影響を調べるために３つの連結パターンでドメインを交換した６種類のキメラ酵素遺伝子を作成し、麹菌へと導入した。生産量は異なるものの、６種の内５種類のキメラ酵素が新たな代謝産物を生産していた。その代謝産物を単離・構造決定したところ、野生型酵素と同一のポリケタイド鎖をもつ化合物であることがわかった。これより、切り出しドメインの交換が他ドメインの機能に影響を与えないことがわかると同時に、ポリケタイド鎖に対する切り出しドメインの基質許容性の一端を解明することができた。
また、jawsamycinの生合成において繰り返し型PKS、独立したKRドメイン及びラジカルSAM酵素の３種の酵素により生合成される特異なポリシクロプロパン骨格の構築機構について検討し、ラジカルSAM酵素による位置及び立体選択的なポリシクロプロパン化のメカニズムを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PKS-NRPSは、炭素鎖の伸長と修飾を厳密に制御する複数の機能単位（＝ドメイン）から構成される多機能性酵素であり、その複雑な多段階反応の解析には、①個々のドメインの機能解析、②ドメイン間の相互作用の解明が必要不可欠であり、これにはドメイン交換実験が有効である。麹菌異種発現系を用いれば、生成した化合物の化学構造からドメインを交換した場合の機能の変化を類推することができる。しかしながら、「ドメインの交換により構造改変したポリケタイド鎖を切り出しドメインが受容できるか否か？」という点については不明であった。そのため、本研究の最初の課題は切り出しドメインの基質許容性の解明にあると考えられた。そこで本年度は、鎖長とメチル基の置換様式が異なるポリケタイド鎖を受容する２種の切り出しドメインを互いに交換したキメラ酵素の機能解析を通して、切り出しドメインの機能解析を試みた。生産した化合物の構造と生産量から、ドメインの連結様式により切り出し活性が変化する一方、切り出しドメインの交換が他ドメインの機能に影響を与えないことを明らかにした。これにより、PKS部のドメイン交換を行うための基礎的知見を得ることができた。また、ポリオレフィン構造をもつポリケタイド鎖に対する特異なポリシクロプロパン化を触媒するラジカルSAM酵素などの解析にも成功した。以上のことから、本研究は概ね順調に進展しているものと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度に実施した切り出しドメインの交換実験から、キメラ酵素遺伝子の作成のための具体的な実験手法の確立に加え連結様式などについての具体的な知見も得ることができた。この知見を基に、次年度以降はPKS部分のドメイン交換実験を行う。具体的には、連結様式が活性に与える影響を考慮して、複数の連結様式でPKS部のドメインを交換したキメラ酵素を作成し、各形質転換体が生産した化合物の構造からドメインの交換が機能に与えた影響を調べる。また、生成したポリケタイド鎖の構造多様化を実現するための材料として、他起源由来の修飾酵素（チトクロームP450、転移酵素、環化酵素）の機能解析も継続する。
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