2017 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries |
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| Project/Area Number |
16H06448
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
脇本 敏幸 北海道大学, 薬学研究院, 教授 (70363900)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 難培養微生物 / 海綿動物 / PKS / NRPS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微生物を起源とする天然物の多くは特異な生物活性を有し、今日の医薬品開発や生化学研究において多大な貢献をもたらしてきた。近年、地球上に生息する微生物のうち99%以上は現在の技術では培養困難であることが示され、これらの微生物は培養に依存した従来の方法では利用困難な状況にある。未利用かつ莫大な生物資源を有効活用するためには、入手可能な遺伝子資源を基盤とする手法の開発が不可欠である。本研究では、多様な医薬品資源の生産能を有する海綿共生微生物に着目し、その遺伝子資源を利用した二次代謝産物の異種生産、大量安定供給の確立を実現する。本研究で確立を目指す技術は海綿共生微生物のみならず、地球上の大部分を占める未利用生物資源、難培養微生物に由来する二次代謝産物の有効利用方法を提示するものである。平成29年度は前年度に引き続きcalyculin A生合成過程の修飾酵素の機能解析を試みた。特にニトリル生合成への関与が示唆されるTEドメインの機能解析を目指し、推定基質の合成を行った。さらにcalyxamide生合成における硫酸基転移酵素や酸化酵素の機能を検討するために、それぞれの推定基質をSNAC体として合成を行った。また、calycullin A生合成の初発段階を担うPKS-NRPSハイブリッドモジュールであるCalA及びkasumigamide生合成の開始モジュールであるKasAをそれぞれ大腸菌を宿主として発現を試みた。いずれにおいても大腸菌内での該当たんぱく質の発現を確認し、モジュール単位での異種発現系の確立に成功した。今後は各機能を確認すべく、推定産物の検出を試みる。さらに今年度は海洋放線菌由来の環状ペプチドsurugamide類の環化酵素の同定を試みた。Surugamide NRPSにはTEドメインが欠落しており、環化を担う酵素は不明であったが、環化前駆体を合成し、新規酵素を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度に引き続きcalyculin A生合成過程の修飾酵素の機能解析を試みた。特にニトリル生合成への関与が示唆されるTEドメインの機能解析を目指し、推定基質の合成を行った。さらにcalyxamide生合成における硫酸基転移酵素や酸化酵素の機能を検討するために、それぞれの推定基質をSNAC体として合成を行った。また、calycullin A生合成の初発段階を担うPKS-NRPSハイブリッドモジュールであるCalA及びkasumigamide生合成の開始モジュールであるKasAをそれぞれ大腸菌を宿主として発現を試みた。いずれにおいても大腸菌内での該当たんぱく質の発現を確認し、モジュール単位での異種発現系の確立に成功した。さらに今年度は前年度に遺伝子クラスターを取得したkasumigamideについてその全合成を行った。Entotheonellaから見出したモジュールの構成はシアノバクテリア由来のクラスターとは大きく異なっていたため、kasumigamideの構造確認を目的に全合成を達成した。その結果、当初提唱されていた構造の立体化学が異なっていることが明らかになった。また、シアノバクテリアからの抽出物をより詳細に解析した結果、新規の類縁体を単離し、kasumigamideと同様に全合成を行うことで新規類縁体の構造を決定した。さらに今年度は海洋放線菌由来の環状ペプチドsurugamide類の環化酵素の同定を試みた。Surugamide NRPSには通常のNRPSに認められるTEドメインが欠落しており、環状ペプチドの環化を担う酵素が不明であった。そこで環化前駆体をSNAC体として合成し、候補酵素であるSurEを大腸菌で発現し、得られた組み替え酵素のin vitroの酵素反応によって、環状ペプチドsurugamide Bが生成することを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度より着手した海綿由来ポリケタイド、ペプチド類の詳細な生合成機構の解析を引き続き進める。特にcalyculin A生合成の酸化的減炭過程の解明やニトリル生合成経路の解析。Calyxamide生合成の硫酸化、α－ケトアミド構造の生成機構やkasumigamide生合成の開始モジュールの反応機構について、それぞれの修飾過程の担うことが予想される生合成酵素を大腸菌で異種発現し、推定基質を有機合成によって調製し、酵素反応の解析を進める。これまでは化学合成した推定基質をSNAC体として調製し、組み替え酵素とのin vitro機能解析を試みてきた。しかしながら、SNAC体基質での反応はほとんど進行しない、あるいは再現性に乏しい場合が多く、酵素機能の検出は困難であった。そこで、SNAC体よりもより本来の基質に近い、ACPやPCP等のキャリアータンパク質に結合した基質の作製を試みた。その結果、昨年度までの検討によって、PKS及びNRPSの生合成中間体を合成し、キャリアータンパク上にloadする手法を確立した。今年度はキャリアータンパク質結合型の基質を用いて、より詳細なin vitro機能解析を進める。
平成29年度に見出した海洋放線菌由来のペプチド環化酵素についてさらに基質特異性や機能の検討を進める。Surugamide類の生合成遺伝子クラスターには４つのNRPS酵素が関与しており、そのうち２つが環状ペプチドであるsurugamide A-Eの生合成を担うことがわかっている。前年度の研究によって、surugamide A-E生合成におけるキャリアータンパク質からの切り出し、環化酵素の同定に成功した。一方で、残りの２つのNRPSは鎖状ペプチドであるsurugamide Fの生合成を担う。Surugamide Fに関してはその切り出し酵素は未同定であるため、今年度中に同定を進める。
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Research Products
(18 results)
