2019 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries |
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| Project/Area Number |
16H06448
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
脇本 敏幸 北海道大学, 薬学研究院, 教授 (70363900)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 海綿 / Calyculin A / 環状ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、地球上に生息する微生物のうち99%以上は現在の技術では培養困難であることが示され、これらの微生物は培養に依存した従来の方法では利用困難な状況にある。未利用かつ莫大な生物資源を有効活用するためには、入手可能な遺伝子資源を基盤とする手法の開発が不可欠である。本研究では、多様な医薬品資源の生産能を有する海綿共生微生物に着目し、その遺伝子資源を利用した二次代謝産物の異種生産、大量安定供給の確立を実現する。本研究で確立を目指す技術は海綿共生微生物のみならず、地球上の大部分を占める未利用生物資源、難培養微生物に由来する二次代謝産物の有効利用方法を提示するものである。先行研究において海綿由来細胞毒性物質calyculin Aが難培養性海綿共生微生物によって生産されることを明らかにした。本研究では詳細な生合成経路を明らかにするために、calyculin A生合成過程の修飾酵素の機能解析を試みている。特にcalyculin A生合成最終段階で必須となる脱リン酸化酵素はこれまで未同定であったため、その同定を目指した。海綿粗酵素液からphophocalyculin A脱リン酸化酵素の単離・精製を進め、LCMS/MSによるペプチド断片配列の解析によって、脱リン酸化酵素がcalyculin生合成遺伝子クラスターにコードされるCalLである事を明らかにした。さらに大腸菌をホストに用いて調製した組換え酵素CalLによっても同様の脱リン酸化活性を検出することに成功した。さらに令和元年度は海洋放線菌より独自に見出した新規ペプチド環化酵素SurEの機能解析を試みた。SurEは7～11残基の様々なペプチドを効率良く環化することができ、N末端にL-アミノ酸、C末端にD-アミノ酸を要求する一方、中間のアミノ酸配列には寛容な基質特異性を示すことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度までの研究成果によってphosphocalyculin A脱リン酸化酵素を海綿粗酵素液から精製し、そのアミノ酸配列からCalLと同定した。しかしながら、native酵素の同定には成功したものの、リコンビナント酵素の活性が確認できていなかった。そこで令和元年度は異種発現条件を種々検討し、リコンビナント酵素での活性発現を達成するとともに、より詳細な活性制御機構の解明を目指した。様々な異種発現条件を検討した結果、シャペロンとの共発現系において、可溶性のリコンビナントタンパク質を得ることに成功した。しかしながら、phosphocalyculin Aを基質に用いた酵素活性試験において脱リン酸化活性を検出することはできなかった。一方で、すでに我々はnative酵素の分画、精製方法を確立していたため、同様の分画手法をリコンビナント酵素に適用した。その結果、シャペロンとCalLを分離し、CalLのみを濃縮した画分を得ることができた。得られた画分を用いて酵素活性試験を行った結果、リコンビナント酵素においてもphosphocalyculin A特異的な脱リン酸化活性を検出することに成功した。さらに難培養性海綿共生微生物Entotheonellaを海綿より分画し、malachite greenによる脱リン酸化反応の可視化に成功し、phosphocalyculin Aからcalyculin Aへの変換反応はEntotheonellaの細胞内で進行していることが分かった。新規ペプチド環化酵素SurEに関しては、様々な基質をペプチド固相合成によって調製し、基質特異性の検証を行った。その結果、SurEは基質両末端のアミノ酸残基の立体化学は厳密に認識するものの、中間のアミノ酸配列に対しては寛容であることがわかり、ペプチド環化生体触媒として有用な特性を有することが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Phosphocalyculin Aの活性化機構は海綿の組織傷害が引き金になることから、物理的傷害から瞬時に伝わる下流の情報伝達機構の存在が示唆される。しかし、その機構に関しては依然として不明である。海綿共生菌Entotheonella内での区画化や、物理的刺激の応答機構を検討するとともに、脱リン酸化酵素自体の詳細な機能解析も含めて、引き続き検討を進めていく。また、calyculin Aの末端ニトリル基の生合成経路が依然として不明である。末端アミドのみを有するcalyculinamide生産海綿より生合成遺伝子クラスターを同定し、遺伝子構成の比較分析によって、候補遺伝子の絞り込みを行う。令和元年度の検討においても問題となったが、Entotheonella由来の酵素の多くが大腸菌を宿主とした異種発現系で可溶性タンパク質として得ることが難しい状況が続いている。今年度は大腸菌以外の新たなホストを適用し、よりEntotheonella由来タンパク質に適した異種発現系の確立を目指す。これらの検討を進め、難培養微生物由来のcalyculin Aの生合成経路の全貌を明らかにするとともに、大量発現系構築へ向けた検討を進める。
希少な環状ペプチドや人工環状ペプチドを合成する上で、有用な生体触媒としてSurEを見出した。今年度はさらに詳細な基質特異性を明らかにし、希少な環状ペプチドの効率的生産に向けた新たな生体触媒の開発を進める。また、放線菌を中心としてゲノムデータベースには膨大なSurEのホモログが認められている。それらのほとんどは未だ機能が特定されていない。そこでホモログ酵素を網羅的に機能解析することで、SurEとは異なる特性を有した環化酵素の同定を進める。多様なホモログ酵素群を生体触媒として応用することで、様々なペプチド鎖に対応したペプチド環化酵素を提供できる。
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