2016 Fiscal Year Annual Research Report
高機能性生体分子の創成をめざした生合成マシナリーの基盤解明
| Project Area | Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries |
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| Project/Area Number |
16H06452
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大利 徹 北海道大学, 工学研究院, 教授 (70264679)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 多価不飽和脂肪酸 / 生合成酵素 / アシルキャリアタンパク質 / アミド結合形成酵素 / ペプチドグリカン / MurD2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①多価不飽和脂肪酸（PUFA）生合成遺伝子に存在するタンデム型のアシルキャリアタンパク質の機能解明を行った。微細藻類Schizochytrium属由来ドコサヘキサエン酸（DHA）合成酵素はOrfA, B, Cで構成され、このOrfAには9個の連続したACPドメインが存在する。DHA生産性とACPドメイン数の関係を調べるために、4から11個のACPドメインを有するorfA遺伝子を遺伝子工学的に再構築しDHA生産性を評価した。その結果、ACPドメイン数の増加に依存したDHA生産性の増加が認められた。
本現象が原核生物由来PUFA合成酵素にも応用できるか検討した。Shewanella属由来エイコサペンタエン酸（EPA）合成酵素は4個の連続したACPドメインを持つ。そこで、ACPドメイン数を5から9個に遺伝子工学的に増加させた酵素を構築しEPA生産性を調べた結果、ACPドメイン数に依存したEPA生産性の増加が認められた。
②これまでに筆者らが見出した、アミノ酸類のカルボキシ末端をATPを用いてリン酸化により活性化し、ペプチド類を求核剤として利用する新規ATP-grasp ligase相同遺伝子の機能解明を開始した。現在、ATP-grasp ligase相同遺伝子を含む推定生合成遺伝子をPCRで増幅あるいはシャトルコスミドにクローニング後、異種宿主で発現させることにより、特異的に生産される代謝産物の同定を行っている。また、微生物のペプチドグリカンの生合成に関与するATP-grasp ligaseである新規酵素UDP-MurNAc-L-Ala-L-Glu synthetase (MurD2)、およびUDP-N-acetylmuramic acid (UDP-MurNAc)-L-Ala-L-Glu epimerase (MurL) を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
多価不飽和脂肪酸に関しては、タンデムに存在するACPドメインが生産性に関与することを明らかにした。現在、最終生産物の制御機構の解明を目的に研究を進めており順調に進展している。ATP-grasp ligaseに関しては、微生物のペプチドグリカンの生合成に関与するATP-grasp ligaseである新規酵素UDP-MurNAc-L-Ala-L-Glu synthetase (MurD2)を見出すなど新たな知見を得ている。他方、ATP-grasp ligase遺伝子を含むクラスターを異種宿主で発現させることによる機能解明の実験で、特異的代謝産物が生産されない場合も多く、今後、複合培養や転写因子の活性化などによる休眠遺伝子の覚醒方法の確立が必要と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
多価不飽和脂肪酸に関しては、互いにサブユニット構造が類似したDHA生合成遺伝子とEPA生合成遺伝子のサブユニット・ドメイン交換を行うことにより最終生成物を決定する遺伝子・ドメインを同定する。ATP-grasp ligaseに関しては、異種宿主発現の際、複合培養や抗生物質ホルミシスなどの方法を用いて眠っている遺伝子の覚醒を試みる。
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