2018 Fiscal Year Annual Research Report
複雑骨格を創成する革新的生合成マシナリーの開拓と精密機能解析
| Project Area | Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries |
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| Project/Area Number |
16H06453
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
葛山 智久 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (30280952)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
白石 太郎 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助教 (40734603)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 生合成 / 放線菌 / 天然物 / ヌクレオシド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度は、前年度までに同定した新奇天然化合物の生合成マシナリーの同定と精密機能解析を継続して行った。具体的には、メチルベンゼン骨格を有するポリエン化合物の生合成マシナリーの精密機能解析を行った。メチルベンゼン骨格を含むポリエン化合物はII型様のポリケチド合成酵素遺伝子を大腸菌で発現させ、これらの組換え大腸菌を利用して、まず４種のケトシンテース（KS）と４種の鎖長決定因子（CLF）の組み合わせを決定することに成功した。これにより、今後は、個々のKSとCLFとの組み合わせでin vitro反応を行い、その生産物を決めていくことで機能を明らかにすることができる。また、ベンゼン環を生成すると予想している酵素の遺伝子を生産放線菌内で破壊することができた。その結果、破壊株では確かにメチルベンゼン骨格を持つ化合物の生産が消失したことから、この遺伝子がメチルベンゼン化合物の生産に関与していることを示すことができた。
また、ヌクレオシド系化合物、具体的には、A-94964の生合成の精密解析を中心に進めた。A-94964生産菌のドラフトゲノムシーケンスとバイオインフォマティクス解析から得られた生合成遺伝子の情報を利用し、個々の生合成反応を推定することでA-94964の生合成経路を提案し、論文として発表することができた。放線菌が生産するナフテルピンやフラキノシンなどのメロテルペノイド生合成の研究を進め、生合成に必須のメチル化反応を触媒する酵素を同定した。並行して、放線菌が生産するアルカロイドであるカルキノスタチンやラバンドキノシンの生合成マシナリーの精密機能解析を進め、ラバンドキノシンついては昨年度発表した鍵酵素に関する総説を発表した。また、カルキノスタチンについては、全生合成経路を提案し、鍵酵素のX線結晶構造解析に成功したので現在論文を執筆中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は、メチルベンゼン骨格を含むポリエン化合物はII型様のポリケチド合成酵素遺伝子を大腸菌で発現させ、これらの組換え大腸菌を利用して、まず４種のケトシンテース（KS）と４種の鎖長決定因子（CLF）の組み合わせを決定することに成功した。また、ベンゼン環を生成すると予想している酵素の遺伝子を生産放線菌内で破壊することができ、破壊株では確かにメチルベンゼン骨格を持つ化合物の生産が消失したことから、この遺伝子がメチルベンゼン化合物の生産に関与していることを示すことができた。ヌクレオシド系化合物の生合成マシナリーの精密機能解析については、A-94964生産菌のドラフトゲノムシーケンスとバイオインフォマティクス解析から得られた生合成遺伝子の情報を利用し、個々の生合成反応を推定することでA-94964の生合成経路を提案し、論文として発表することができた。イソインドリノン骨格という新しい骨格をもつポリケチドを単離し、その生合成マシナリーを同定することに成功し、論文として発表することができた。さらには、カルキノスタチンについては、全生合成経路を提案し、鍵酵素のX線結晶構造解析に成功したので現在論文を執筆中である。班員間の共同研究も積極的に進め、A01班公募班の工藤史貴博士とはホスホン酸化合物であるfosfomycinのメチル化機構に関して論文を発表することができた。またA02班計画班の脇本敏幸博士とはヒドラジンの生合成マシナリーの同定に関して論文を発表することができた。以上の成果から、順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は引き続き、ヌクレオシド系生物活性物質とポリケチド化合物の生合成マシナリーの同定と精密機能解析を継続する。具体的には、ヌクレオシド系生物活性物質としてアミプリマイシン、ミハラマイシン、アングストマイシン、ポリケチド化合物としてメチルベンゼン骨格を有するポリエン化合物の生合成マシナリーの精密機能解析を行う。同定した生合成マシナリーを用いて、ヌクレオシド系化合物の新規誘導体を作出する研究にも着手する。また、一昨年度に明らかにしたトリコスタチンの生合成酵素の結晶化についても引き続き進める。これまでに、酵素の精製条件が完了し、in vitroでの酵素活性も検出できていることから、結晶が得られれば活性型酵素の構造解析が可能になる。
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[Journal Article] Biochemical and structural analysis of FomD that catalyzes the hydrolysis of cytidylyl (S)-2-hydroxypropylphosphonate in fosfomycin biosynthesis2018
Author(s)
Sato, S., Miyanaga, A., Kim, S. Y., Kuzuyama, T., Kudo, F., Eguchi, T.
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Journal Title
Biochemistry
Volume: 57
Pages: 4858-4866
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Discovery of unprecedented hydrazine-forming machinery in bacteria2018
Author(s)
Matsuda, K., Tomita, T., Shin-ya, K., Wakimoto, T., Kuzuyama, T., Nishiyama, M.
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Journal Title
J. Am. Chem. Soc.
Volume: 140
Pages: 9083-9086
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] C-Methylation Catalyzed by Fom3, a Cobalamin-Dependent Radical S-adenosyl-l-methionine Enzyme in Fosfomycin Biosynthesis, Proceeds with Inversion of Configuration2018
Author(s)
Sato, S., Kudo, F., Kuzuyama, T., Hammerschmidt, F., Eguchi, T.
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Journal Title
Biochemistry
Volume: 57
Pages: 4963-4966
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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