2018 Fiscal Year Annual Research Report
Recognition of compartment by microglia and its regulation of Scrap&Build
| Project Area | Dynamic regulation of brain function by Scrap & Build system |
|---|
| Project/Area Number |
16H06458
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
鈴木 淳 京都大学, 高等研究院, 教授 (30511894)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
|
| Keywords | 神経 / スクランブラーゼ / 活性化因子 / sgRNA library / ホスファチジルセリン / FACS / 次世代シークエンサー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに神経細胞特異的に発現しているスクランブラーゼXkr4において、生きた細胞において恒常的に活性化する変異体を同定している。しかしながらXkr4を活性化させる因子については分かっていない。Xkr4はアポトーシス刺激において活性化させることができるため、死にゆく細胞を用いてスクリーニングを行う必要があるが、スクランブラーゼ活性がなくても細胞は死ぬことができるため通常のスクリーニングでは遺伝子同定ができない。そこで死にゆく細胞を用いても遺伝子同定ができる”Revival screening”の実験系を樹立することにした。まず、アポトーシス時にはDNAが切断されるため、DNaseをノックアウトし切断されないようにした。次に、CRISPR Cas9 sgRNA libraryを導入後、アポトーシス刺激を行い、PSを露出していない細胞をFACSによりソーティングした。この細胞より濃縮されたsgRNA libraryを調製し、再度スクリーニングを行った。この過程を数回繰り返すと、濃縮されたlibraryの導入によりPSの露出を顕著に抑制することができた。そこで、この細胞に組み込まれたsgRNAを次世代シークエンサーで解析し、Xkr4活性化の候補因子を得ることができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR screeningによりスクランブラーゼ活性化の候補因子を得ることができたため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR screeningによって得られたスクランブラーゼ活性化の候補因子について、その機能を詳細に調べる。
|
