2016 Fiscal Year Annual Research Report
Visualization and photomanipulation of migrating neuronal cells and surrounded field during the formation of brain tissue
| Project Area | Interplay of developmental clock and extracellular environment in brain formation |
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| Project/Area Number |
16H06487
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松田 知己 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (50419206)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | ライブイメージング / 蛍光タンパク質 / 化学発光 / 細胞動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
場（細胞外環境）と神経細胞の連携という新たな視点で脳発生時間の制御機構を解明することを目的とした本領域の研究の発展には、神経細胞のダイナミックな移動に伴う分子・細胞機能の変化を視覚化するイメージング手法が不可欠である。本研究では、領域内研究でのライブイメージングに有用なツールの開発を行なっている。
研究グループの着想に基づいたイメージングツール開発として、化学発光タンパク質と蛍光タンパク質の間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の原理を利用し、化学発光タンパク質領域からの発光と蛍光タンパク質領域からの発光の強度比の変化によりCa2+濃度を検出するセンサーを開発した。発光領域として化学発光タンパク質NanoLucと黄色蛍光タンパク質Venusもしくは緑色蛍光タンパク質mNeonGreenおよびそれらの変異体を用い、Ca2+検出領域としてCalmodulin-M13もしくはトロポニンCおよびその変異体を用いてスクリーニングを行なった。その結果、N末端側より、VenusのC末端欠失変異体、トロポニンC変異体、NanoLucの順に融合することにより、これまでの化学発光Ca2+センサーで最大のダイナミックレンジ（350％）を示すセンサーを開発することに成功した。しかし、同様のセンサーが別のグループから発表されてしまったため、赤色蛍光タンパク質を用いたCa2+センサーの開発に移行し、tdTomatoを用いたダイナミックレンジ250％の赤色化学発光Ca2+センサーを開発した。
領域研究者メンバー同士の情報交換で着想を得たイメージングツールとして、N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブを仲嶋班との共同で開発している。プローブのデザインと遺伝子コンストラクトの作製を行なった。N-カドヘリン挿入により蛍光タンパク質蛍光強度が大きく減少することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FRETを利用した化学発光Ca2+センサーの開発は当初順調に進んで論文発表を行う段階にまで到達していたが、平成28年10月末、同様のCa2+センサーに関する研究成果が他の研究グループからNature communications 誌に発表されてしまったため、発表の機会を逸してしまった。しかし、Ca2+センサーのデザインを再検討し、赤色蛍光タンパク質を用いたCa2+センサーの開発に移行し、スクリーニング実験によりtdTomatoを用いたダイナミックレンジ250％の化学発光Ca2+センサーを開発するに至った。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては予定通り仲嶋班との共同開発に着手している。
以上は当初の計画と異なる点もあるが、おおむね順調と考えられる結果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
化学発光Ca2+センサーについては、引き続き生細胞内でのイメージングによる検証を行う。研究グループの着想に基づいたイメージングツール開発として、低pH耐性を持った緑色蛍光タンパク質・Ca2+親和性の低い化学発光Ca2+センサーの開発等に着手している。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブに関しては、発現に用いるプロモーター領域、異なる蛍光タンパク質の検討による発現レベルの向上を目指すとともに、発現レベルの低下の原因を蛍光観察、ウエスタンブロッティング等により検証する。
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