2017 Fiscal Year Annual Research Report
Visualization and photomanipulation of migrating neuronal cells and surrounded field during the formation of brain tissue
| Project Area | Interplay of developmental clock and extracellular environment in brain formation |
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| Project/Area Number |
16H06487
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松田 知己 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (50419206)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | ライブイメージング / 蛍光タンパク質 / 化学発光 / 細胞動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
場（細胞外環境）と神経細胞の連携という新たな視点で脳発生時間の制御機構を解明することを目的とした本領域の研究の発展には、神経細胞のダイナミックな移動に伴う分子・細胞機能の変化を視覚化するイメージング手法が不可欠である。本研究では、領域内研究でのライブイメージングに有用なツールの開発を行なっている。
研究グループの着想に基づいたイメージングツールとして昨年度に開発した、化学発光タンパク質と赤色蛍光タンパク質の間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の原理を利用して発光強度比の変化によりCa2+濃度を検出するセンサーについて、生細胞内でのイメージングに使用可能であることを検証した。また、ハナガサクラゲから遺伝子クローニングした蛍光タンパク質を改良することにより、リソソーム・液胞・分泌小胞・エンドソームなどの酸性細胞小器官（pH=4.5から5.5）内で蛍光を失わない耐酸性緑色蛍光タンパク質を開発し、細胞内でのイメージングに応用することに成功した。
領域研究者同士の情報交換から着想を得たイメージングツールとして開発中のN-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては、発現に用いるプロモーター領域、異なる蛍光タンパク質の検討を行なったが発現レベルの向上は見られなかった。また、ウエスタンブロッティングでの解析により、蛍光タンパク質の挿入によりN-カドヘリンの発現量が低下していることが分かった。そこで、挿入する蛍光タンパク質をこれまで用いていたβバレル構造をとる蛍光タンパク質からサイズの小さいニホンウナギ由来緑色蛍光タンパク質UnaGに変えたところ、顕著な蛍光強度の改善が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FRETを利用した化学発光Ca2+センサーの開発は、他グループからの同様のセンサーの発表に伴う昨年度からの軌道修正が順調に進み、新たに開発したシアン-赤色センサーが細胞内で機能することを検証するまでに至っている。また、別の視点から開発を進めていた、ハナガサクラゲ由来の耐酸性緑色蛍光タンパク質については、ライブイメージングへの応用に十分な蛍光強度を持つ改変体を得ており、今後酸性オルガネラ内のライブイメージングの汎用ツールとして広く用いられることが期待される。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては、蛍光タンパク質発現量に関して問題に直面しているが、ニホンウナギ由来の蛍光タンパク質を用いることによって解決する兆しを得ている。
以上は当初の計画と異なる点もあるが、おおむね順調と考えられる結果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究グループの着想に基づいたイメージングツール開発として、小胞体内でのCa2+イメージングに適した親和性の低い化学発光Ca2+センサーの開発、光照射依存的に活性酸素を産生することにより任意のタイミングで標的分子・細胞を不活性化する光増感緑色蛍光タンパク質の開発を進める。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブに関しては、ニホンウナギ由来の蛍光タンパク質を開発の中心に据えて蛍光強度の増強を目指し、さらには相互作用検出のための分子デザインを試みる。
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