2018 Fiscal Year Annual Research Report
Visualization and photomanipulation of migrating neuronal cells and surrounded field during the formation of brain tissue
| Project Area | Interplay of developmental clock and extracellular environment in brain formation |
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| Project/Area Number |
16H06487
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松田 知己 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (50419206)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | ライブイメージング / 蛍光タンパク質 / 化学発光 / 細胞動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、場（細胞外環境）と神経細胞の連携という新たな視点で脳発生時間の制御機構を解明することを目的とした本領域の研究の発展に不可欠な、神経細胞のダイナミックな移動に伴う分子・細胞機能の変化を捉えるライブイメージングツールの開発を行なっている。
研究グループの着想に基づいたイメージングツールとして、小胞体等の高Ca2+濃度の細胞内小器官でのイメージングに適した低親和性の化学発光Ca2+センサー、および光刺激により活性酸素種を産生して近傍のタンパク質を破壊する緑色蛍光タンパク質に関する論文を発表した。また、蛍光と化学発光のどちらの検出モードにおいてもCa2+濃度変化を観測することのできるバイモーダルセンサーに関して本年度から開発を開始した。蛍光タンパク質を用いたCa2+センサーの両末端に、分割した化学発光タンパク質の片側ずつをそれぞれ融合したコンストラクトをデザインして開発を進めた。ドメイン間のリンカーアミノ酸配列を改良して、蛍光モードでは既存の蛍光Ca2+センサーと同様の、化学発光モードでは既存の生物発光Ca2+センサー中で最大のダイナミックレンジを示すセンサーを得た。
領域研究者同士の情報交換から着想を得たイメージングツールとして開発中のN-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについて、分割したニホンウナギ由来緑色蛍光タンパク質UnaGをカドヘリンに挿入したプローブを検討していた。HEK293T細胞内でカドヘリンと融合させた各断片を共発現させた場合にはシグナルを確認することができたものの、各断片を別々の細胞に発現させて細胞間相互作用の検出を試みた場合にシグナルを検出することが出来なかった。そこで、二量体形成により蛍光発光するようになるβバレル型蛍光タンパク質のペア（ddGFP）を用いたプローブを新たに作製し、細胞間相互作用を検出することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
低親和性の化学発光Ca2+センサー、光刺激により活性酸素を産生する緑色蛍光タンパク質といった新規プローブに関して論文発表に至っている。本年度から開発を開始した蛍光・化学発光バイモーダルセンサーに関しては、予定通りに、精製タンパク質を用いたアッセイで蛍光モード・化学発光モードのいずれにおいても大きなシグナル強度変化を起こすセンサーを得ることができた。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては、昨年から開発を進めていたニホンウナギ由来の蛍光タンパク質を用いたプローブを検討していたものの検出がうまくいかなかった。しかし、新たに二量体形成により発光する蛍光タンパク質のペアを用いることによりそれを克服することに成功している。
以上は当初の計画と異なる点もあるが、おおむね順調と考えられる結果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光・化学発光バイモーダルセンサーに関しては、本年度の精製タンパク質を用いたアッセイで、蛍光・化学発光モードのいずれにおいてもCa2+の有無で大きな蛍光強度変化を起こしたコンストラクトについて細胞内での評価を行う。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブに関しては、本年度にプロトタイプの作製に成功した、二量体形成により蛍光発光することのできる蛍光タンパク質のペアを用いたプローブのさらなる改良を行い、さらに分散培養した神経細胞やスライスカルチャー内での評価を行う。
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