2018 Fiscal Year Annual Research Report
Structural analysis of neo-self
| Project Area | Creation, function and structure of neo-self |
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| Project/Area Number |
16H06500
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
横山 茂之 国立研究開発法人理化学研究所, 科技ハブ産連本部, 特別招聘研究員 (00159229)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
笹月 健彦 九州大学, 高等研究院, 特別主幹教授 (50014121)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 免疫学 / タンパク質 / アレルギー・ぜんそく / 立体構造 / MHC / TCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. スギ花粉抗原Cry j 1由来ペプチドpCj1とHLA-DP5（細胞外領域）の複合体（pCj1・HLA-DP5）の可溶性試料は、ゲル濾過分析により、単量体と６量体の混合物であることが分かった。N端側隣接領域を削除したペプチドでは、６量体が減少し、単量体が増加した。(横山)
2. HLA-DP5発現HEK293細胞について、野生型ペプチド（pCj1）と、N端側隣接領域の２残基（6量体形成に関与）の変異体ペプチドのHLA-DP5結合親和性は、野生型ペプチドと比較し、約２分の１であることがわかった。（横山、荒瀬）
3. pCj1・HLA-DP5（細胞外領域）の単量体試料を調製して、患者由来のT細胞受容体（TCR）（細胞外領域）との相互作用を表面プラズモン共鳴によって解析したところ、通常のTCRと同程度に弱かった。(横山)
4. 膜貫通領域を含む全長のTCR（αβ）とCD3（ヘテロ６量体）との複合体（ヘテロ８量体）を無細胞タンパク質合成法により調製する条件を改良し、大量調製を可能にし、クライオ電顕の単粒子解析の試料とする検討を開始した。(横山)
5. HLA-DP5とpCry j-1を認識するTCRを発現したTG40細胞を用いて、HLA-DP5発現マウス抗原提示細胞（mDC）とpCry j-1によって刺激し、T細胞活性化（IL-2産生量）の解析を継続した。T細胞活性化は、HLA-DP5ホモ会合の２つの界面の一方の変異によりそれぞれ約20%に低下し、それらを組合せた２重変異で数％にまで低下した。（笹月）
6. HLA-DP5が相関する自己免疫疾患（グレーブス病）に関して、甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）全領域の中からT細胞を活性化するペプチドを同定するとともに、これを認識するT細胞から、複数のTCRαとTCRβの遺伝子のクローニングを継続して行った。（笹月、岸）
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. HLA-DP5（細胞外領域）は溶液中でもホモ６量体を形成する傾向があり、さらに、ペプチドのN端側隣接領域によってホモ６量体が安定化されることを明らかにし、結晶化のアーティファクトではないことを確立した。さらに、HEK293細胞に発現したHLA-DP5に対し、ペプチドの親和性がN端側隣接領域によって２倍になることが明らかになり、細胞におけるホモ６量体形成が支持された。また、２倍の親和性は、マウス抗原提示細胞の表面に提示されるpCj1の量が、そのN端側隣接領域によって約２～３倍になることと対応する。以上、これまでと異なる観点から、HLA-DP5のホモ６量体形成と、N端側隣接領域による安定化が証明された。
2. ホモ６量体形成に関与するHLA-DP5の界面に２重変異を加えると、マウス抗原提示細胞の表面に提示されるpCj1の量は半分程度残るのにも関わらず、そのマウス抗原提示細胞によるT細胞活性化は、ほぼ完全に阻害される。このことから、T細胞活性化におけるホモ６量体形成の意義は、抗原提示細胞におけるペプチドの全体量の増加より、６量体のスケールで局所密度を最大化していることにあることが強く示唆され、抗原提示様式の解明に向けて、大きく前進した。
3. ホモ６量体形成を手がかりとする解明を進めるには、TCRを含む立体構造の解明が最も重要である。全長のTCR（αβ）とCD3（γε・δε・ζζ）の複合体の大量調製を可能にして、クライオ電顕やX線結晶構造解析の準備を整えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. pCj1・HLA-DP5複合体を認識する患者由来TCRの膜貫通領域を含むTCR・CD3ヘテロ8量体試料について、結晶化スクリーニングを進めるとともに、クライオ電顕の単粒子解析を進め、TCR・CD3ヘテロ8量体の立体構造として世界初の成果を目指す（横山）。
2上 述1.のTCR・CD3ヘテロ8量体について、pCj1・HLA-DP5との複合体の構造解析に向けて、手法の検討を進める。（横山）。
3. pCj1・HLA-DP5のホモ会合体形成とTCRのナノクラスター形成との間の関連を検討するため、横須賀班の1分子イメージングと連携し、試料および情報を提供する（横山）。
4. HLA-DP5と、グレーブス病の自己抗原TSHR由来ペプチド（pTSHR）との複合体の結晶構造解析を進め（横山）、pCj1・HLA-DP5の結晶構造と比較して、自己抗原と外来抗原についての提示様式の差異と共通性を明らかにすることを目指す（笹月）。
5. 外来抗原と自己抗原のネオ・セルフを比較する第二のターゲットとして、HLA-DR53を取り上げ、スギ花粉症のCry j-2と自己免疫疾患（橋本病）のTGについて、反応する患者T細胞を用いて、ペプチドの同定（pCj2、pTG）とTCR遺伝子のクローニングを進める（笹月、岸）。最終的には、pCj2・HLA-DR53とpTG・HLA-D53の結晶構造解析を行い、pCj1・HLA-DP5とpTSHR・HLA-DP5との比較と合わせて、ネオ・セルフの普遍的な解明を目指す（横山・笹月）。
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