2019 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis for neo-self in MHC-misfolded protein complex
| Project Area | Creation, function and structure of neo-self |
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| Project/Area Number |
16H06501
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
横須賀 忠 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (10359599)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
末永 忠広 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (20396675)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | T細胞受容体 / マイクロクラスター / MHC / ミスフォールド蛋白質 / ネオ・セルフ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（1）vablumin（OVA）抗原の変異リガンドと特異的TCR OT-Iトランスジェニック（Tg）の系を樹立し分子イメージングを行った。TCRがエンドサイトーシスされず凝集して細胞表面に残存するような強いStrengthのシグナルはネガティブセレクションを誘導し、凝集したTCRには持続的にシグナル伝達分子がリクルートしTCRシグナルのDurationに寄与しているという、末梢T細胞とは正反対の興味深い結果を得た。（2）ヒト（h）CD19抗原に対するキメラ抗原受容体（Chimeric antigen receptor : CAR）のイメージング解析から、CARが腫瘍抗原認識する際には、内在性TCRがTCRマイクロクラスターを形成しCARシグナルを増強すると共に、CD4/CD8などのT細胞共受容体もCARシグナルを補完することが分かった。CD8陽性細胞傷害T細胞とCD4陽性ヘルパーT細胞とではCARから伝達される刺激強度に相違があることから、実臨床でのCAR-T療法のT細胞サブセットにおける活性化の違い、既往CAR-T細胞としての残存率など生理的に重要な分子機構を明らかにした。（3）hCD19-CARとhCD5-CARとを比較検討したイメージング解析を行い、免疫チェックポイント受容体から受けるCAR-T細胞抑制とそれによる自己反応性の回避やCAR-T細胞疲弊を誘導する分子機序に関して研究した。（4）花粉Cryj1抗原ペプチド存在下にHLA-DP α1*02:02 β1*05:01の自発的凝集が確認すると共に、四量体形成に重要と考えられるHLA-DPのcis結合部位に変異を加えたタンパクを精製し、同様にCryj1抗原ペプチドによるHLA凝集を解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
胸腺選択において、どの程度の強度のTCRシグナルがセルフとノン・セルフ、ネオ・セルフを識別するのか、TCRの親和性によって決定されるという仮説を、胸腺T細胞のTCRマイクロクラスター形成の有無や強弱をアウトプットに関連付けて理論的に説明できている。OVA抗原の変異リガンドAPLと特異的TCR OT-I T gの系においても、またE3ユビキチンリガーゼCblの遺伝子欠損マウスを用いた実験系においても解析は順調に進んでいる。イメージングから求められた仮説を生理学的見地から検証するため、胎児胸腺器官培養の実験も進め、野生型の解析は終了し、Cbl欠損マウスにおけるPalmerラインのシフトを解析中である。またこれまでTCRのエンドサイトーシスと消化・再利用のための機能としてc-SAMCが考えられていたが、胸腺細胞においてはc-SMACにリン酸化タンパク質分子が集まっており、c-SMACがシグナロソームである可能性を発見した。ヒトhCD19抗原に対するCARのイメージング解析から、腫瘍抗原を認識する際のCARマイクロクラスターと内在性TCRとのクロストークを可視化できただけでなく、細胞傷害性T細胞とヘルパーT細胞でのCARの活性化がCD4とCD8というコリセプターの違いから制御され得るのか、CD4とCD8αβによるCARのチロシンリン酸化、シグナロソームとしての構造、およびSrcファミリーキナーゼLckの寄与に関する一定の結果が得られ、正常T細胞でのコリセプターの役割をシグナロソームの視点から解析し、一定の結果が出せている。花粉抗原Cryj1と共に四量体形成を示すHLA-DPα1*02:02 β1*05:01の1分子イメージング実験系に関しては、野生型HLAを完成させ、四量体を形成しない変異体HLAの樹立へと進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
（1）分子イメージングによって明らかとなった、胸腺選択でのセルフとノンセルフを識別するTCRシグナロソームとそれを形成するTCRシグナルのStrengthとDurationを、実際の胸腺選択においても当てはまるかどうか検証するため、胎児胸腺臓器培養FTOCを用いた実験を進める。前段階の結果ではセルフとノンセルフの境界はイメージングに比較して明確ではなく、胸腺T細胞の移入ではなく直接胸腺器官に抗原ペプチドをパルスして用い、セルフとノン・セルフの境界で起こり得るネオ・セルフ胸腺選択をPalmerラインの推移によって検証する。（2）CD4およりCD8が欠損したT細胞培養株を、TCRの特異性を数種類（MCC、OVA、LCMV）代えたラインで作成した。CAR-T細胞には共刺激受容体が必要ないのかnullな条件で確認する。またTCRα;鎖flox×エストロゲン受容体ERT2-Creマウスを用いて、Primary T細胞を用いた分子イメージング実験やマウスin vivoでのCAR-T細胞のメモリー化や維持の確認実験を予定している。（3）CD155をリガンドとして持つTIGITとCD96はそれぞれの分子の高さが特にT細胞と抗原提示細胞および標的細胞の接着面における分子の分布に影響している。CARのStalkのデザインを代えることでCAR-T細胞上の他の分子との相互作用を制御できる可能性を検討する。補助刺激による抑制が解除されることによるセルフとしての認識のためのシグナルが増強されネオ・セルフ化するかhCD19/hCD5 CAR-T細胞を用いて検討する。（4）HLA-DP α1*02:02 β1*05:01および四量体形成に不具合を生む変異体2種類の分子イメージング解析を１分子イメージングからさらに詳細な解析を行う。
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