2018 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | New Photosynthesis : Reoptimization of the solar energy conversion system |
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| Project/Area Number |
16H06557
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| Research Institution | Kwansei Gakuin University |
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Principal Investigator |
宗景 ゆり 関西学院大学, 理工学部, 准教授 (30423247)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 祐介 関西学院大学, 理工学部, 教授 (30291975)
古本 強 龍谷大学, 農学部, 教授 (30313208)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 光合成制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．C4光合成におけるサイクリック電子伝達の機能の解明: CRISPER/Cas9によるゲノム編集技術を用いて、PGRL1またはNdhOのノックアウト株の作成を行い、gRNAのターゲット配列であるPGRL1に14bpのdeletionを、NdhOについては15bpのinsertionを確認した。また、C4種Flaveria NPQ7-RNAiノックダウン株の解析結果から、NPQ7は光化学系IIの非化学的消光（NPQ）だけでなく光化学系II複合体形成に関わる可能性が示唆された。
２．CP12-3によるC4代謝制御システムの解明: CP12-3機能抑制株と野生株それぞれからの抽出タンパク質において、PRK、MDHおよびGAPDHの複合体構成を2次元展開によって検討した。その結果、GAPDHの複合体構成に異常を見いだした。これはGAPDHがCP12-3と単独で結合しうることを示している。
Bass4機能抑制株の光合成を測定し、光合成がとても低くなることに加え、とくにこの傾向が弱光条件下で顕著なことがわかった。
３．無機炭素濃縮機構と連動したプロトン駆動力制御機能の解明: 海洋性珪藻2種、P. tricornutumおよびT. pseudonanaからBestrophin様膜タンパク質遺伝子を2つずつ単離し、GFP標識および免疫TEMによる局在決定を行った結果、これらがチラコイド膜因子であることが分かった。また、両珪藻からPyshell遺伝子をやはり2つずつ単離したが、それぞれ同一配列だった。この2種のPyshellの局在はピレノイドであり、またこの過剰発現とノックダウンは光合成の無機炭素親和性に大きな影響を与えることが分かった。一方、珪藻が有する葉緑体、細胞膜共局在型アクアポーリンが、CO2/NH3チャンネルとして働き、強光耐性をもたらすことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．CRISPER/Cas9によるゲノム編集技術を用いたノックアウト株の作成は順調に進展している。確認されたdeletionにより、PGRL1遺伝子にストップコドンが入ることが予測され、現在のヘテロ系統から、次世代においてホモ系統のノックアウト株を取得することが期待できる。NPQ7ノックダウン株の解析を進めることで光化学系II複合体形成に関わるシステムを解明することが期待できる。
２．BN-PAGE/SDS-PAGEの2次元電気泳動法によるタンパク質複合体構成の調査手法を確立し、CP12-3機能抑制株と野生株それぞれから抽出したタンパク質に適用することで、PRK、MDHおよびGAPDHの挙動の変化を調査した。その結果、GAPDHの複合体構成に異常を見いだした。これはGAPDHがCP12-3と単独で結合しうることを示している。
Bass4機能抑制株の光合成を測定し、光合成が２０％程度まで低くなることに加え、とくにこの傾向が弱光条件下で顕著なことがわかった。高光量においてわずかに光合成活性が見いだされた。Bass4を介さない物質輸送とBass4を解する物質輸送の二つが存在し、Bass4依存的な回路が主として働くことと介さない回路が高光量領域で機能する可能性を示唆する。
３．これまで見つかっている重要因子の単離と局在解析は順調に進んでいる。また、RNA干渉による特異的発現抑制も結果が出始めている。CRISPR/Cas9およびTALEN法によるゲノム編集株が得られ始めているほか、CRSPR/Cas9nickaseを使ったより特異性の高いDNAダブルカットによるゲノム編集に使用の目途が立った。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．C4光合成におけるサイクリック電子伝達の機能の解明: CRISPER/Cas9ゲノム編集技術を用いて作成した株は、ヘテロでの遺伝子deletionまたはinsertionが確認されているため、次世代でホモ系統を選抜する。さらにこれらを用いて、細胞特異的プロモーターにより細胞特異的に遺伝子発現を相補した系統を作成し、葉肉細胞または維管束鞘細胞それぞれにおけるサイクリック電子伝達の重要性を明らかにする。
また、引き続きC4種Flaveria NPQ7-RNAiノックダウン株の解析を進める。
２．CP12-3によるC4代謝制御システムの解明: GAPDHとCP12-3がin vitroで結合することを示す再構成実験を行う。GAPDHはA2B2複合体を構成するうえに、葉肉細胞と維管束鞘細胞のそれぞれの細胞に発現する。CP12-3との結合は、CP12-3が局在する維管束鞘細胞葉緑体で起こっていると推定されるので、（1）維管束鞘細胞葉緑体で機能するGAPDH分子種をまず特定し、ついで（2）in vitroでの複合体再構成実験を行う。Bass2が60kDaの2量体のサイズを示した一方で、Bass4が240kDaの大きな複合体を構成すると推定された。この複合体組成を確認する。
３．無機炭素濃縮機構と連動したプロトン駆動力制御機能の解明: BestおよびPyshell等の重要因子の機能決定を行うとともに、これらに相互作用する因子、および新奇ピレノイド因子の探索と単離、機能決定を行い、無機炭素濃縮とプロトン駆動力制御の関りを解明する。
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