2016 Fiscal Year Annual Research Report
Control of proton motive force components by ion transport system
| Project Area | New Photosynthesis : Reoptimization of the solar energy conversion system |
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| Project/Area Number |
16H06558
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
魚住 信之 東北大学, 工学研究科, 教授 (40223515)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川崎 寿 東京電機大学, 工学部, 教授 (90349788)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 膜輸送体 / 膜電位 / プロトン駆動力 / イオン / チラコイド膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
光合成の電子伝達系の舞台であるチラコイド膜ではプロトンの輸送に関与する輸送体は非常によく研究されており分子の同定も進んでいる。一方プロトン駆動力は膜電位と pH 差である。膜電位はプロトンのみならず，他のイオンによっても影響を受けるこうである。しかしプロトン以外のイオンの輸送体に関してはほとんどわかっていない。本研究において道のチラコイド膜に存在するイオン輸送体を同定し機能解析を進めて膜電位形成に関与するイオン輸送に関する知見を得ることを目標としている。本年度は何層のイオン輸送体および植物の葉緑体チラコイド膜に発現すると考えられているアンチポーター及びそのホモログについて検討を行うこととした。藍藻のNhaS3トランスポーターはチラコイド膜に存在していると考えられているが，抗体がなく検証ができない状態である。このため今回交代を作成することを行った。また藍藻のK，Na，Clに関する輸送体遺伝子が不明であることから，その推定される輸送体遺伝子の発現を検討するためにレポーター遺伝子を作成した。さらに，植物シロイヌナズナのチラコイド膜で機能すると考えられている KEA3トランスポーターは，直接輸送活性を検出した報告はなく，イオン選択性に関しても明確ではない。輸送活性の測定には細胞内小器官が必要であると考えており，通常用いられる酵母では輸送活性検討が難しいと考えられている。KEA3とそのホモログのKEA1-KEA2の輸送体の遺伝子をクローン化して大腸菌で発現させることを試みた。藍藻の陰イオンの輸送体についても輸送活性を明らかにするため検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
筆者らは以前に藍藻の NhaS3トランスポーターはチラコイド膜に局在することを示している。NhaS3は光合成にも影響を与える可能性も予想されている。しかし，細胞内局在性を検討するために GFP の融合タンパク質を作成して藍藻に導入した。また NhaS3の C 末端領域にある水溶性領域を認識する抗体の作成を目指してマルトース結合タンパク質融合タンパク質の遺伝子を作成したその融合タンパク質を大腸菌から精製を行った（研究代表者）。
シロイヌナズナの K/Hアンチポーターと考えられているKEA3トランスポーターのcDNAをクローニングして，大腸菌で発現させた。 KEA3遺伝子は三つのバリアントが存在していたことからそれぞれcDNA を合成して大腸菌発現に用いた。作成したプラスミドを大腸菌のK要求性株に導入して生育テストを行った結果5種類ともにK要求性の変異を要求することが分かった。膜輸送体の活性測定は異種発現系を用いることとなるので，K輸送体の膜への挿入様式が課題となることがある。微生物のK輸送体が正しく真核生物の小胞体膜に挿入することが明らかとなった（研究代表者）。
藍藻のK, Na. Clに関わる輸送体の遺伝子の概日性リズムを調べるためにここのプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子に連結したプラスミドを作成した。その遺伝子を藍藻に導入して，染色体に挿入した藍藻を選別している（研究代表者）。
ラン藻の陰イオン輸送体候補遺伝子４種類のうち３種類について大腸菌での発現確認を主目的に種々のタグとの融合型発現プラスミドを構築した。候補遺伝子２種類については、発現量はわずかであるものの大腸菌膜での発現を確認した。前例の無い「シロイヌナズナのチラコイド膜をパッチクランプ法で解析する方法」について検討を開始し、bleb様構造体の形成と数百メガΩのシールに成功した（研究分担者）。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回の検討から，NhaS3と GFP の融合タンパク質の大腸菌における発現を試みている.
抗NhaS3抗体を作るためのエピトープとなるタンパク質の精製も大腸菌から順調に行われており現在ウサギの血清を得ることができたので，本抗体の特異性を調べることを予定している。また，シロイヌナズナの KEA3アンチポーターの3種類のcDNAをクローン化することに成功しており，今後イオン輸送活性について検討することを考えている。特に。アンチポート活性に関しては大腸菌の反転膜小胞を調製して，プロトンの輸送活性を蛍光試薬を用いて検出する予定である。さらに藍藻のK, Na. Clに関わる輸送体の遺伝子のルシフェラーゼ遺伝子構築も順調に進んでおり概日性リズムや高い塩ストレスなどによる誘導発現を検討する予定である。
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