2019 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Transomic Analysis of Metabolic Adaptation |
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| Project/Area Number |
17H06305
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
伊藤 隆司 九州大学, 医学研究院, 教授 (90201326)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
梅山 大地 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 研究員 (30706370)
荒木 啓充 九州大学, 経済学研究院, 助教 (60572823)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | エピゲノム / DNAメチル化 / PBAT / TACSライゲーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
次世代メチローム解析技術の開発：次世代型PBATの基盤技術としてTACS ligation法を開発し、これとランダムプライミングを組み合わせたtPBAT法を確立して、論文発表を行った。tPBATについては領域内のメチローム解析支援にも活用されて順調に稼働中である。
tPBAT法は、PBAT原法の欠点であったインサート長の短さと極微量解析時における人工産物の増加を克服したものの、GC含量によるバイアスは解消できていない。そこで、バイサルファイト変換DNAの末端を修復してTACS ligationでアダプタを付加し、そこから伸長した相補鎖の末端に再度TACSライゲーションによるアダプタ付加を行う方法を試みて、バイアスの解消に成功した。しかしながら、インサート長の更なる伸長効果は明確でなかった。一方、２番目のアダプター付加をTACSライゲーションではなく、T4 DNAリガーゼで行うプロトコルも検討し、相補鎖合成に利用するDNA合成酵素を各種検討した結果、インサート長が更に伸びることが見いだされたため、このプロトコルの最適化を進めることとした。更に非バイサルファイト法であるEM-seqの評価を行うとともに、ここで用いるAPOBECを利用してACE-seqによるヒドロキシメチル化解析にも取り組んだ。
データ解析については、脳腫瘍および骨腫瘍のメチロームデータに独立成分分析を適用することによって、腫瘍の種類に関わらずヒストンH3.3のGly34変異に特異的なメチロームシグナチャを見い出すことに成功し、新しいメチロームデータ解析法の可能性を示すことができた。
次世代ゲノムフットプリント法の開発：DMS-seqに関しては、TACSライゲーションの応用によるライブラリ作成法の改良を進めた。DamID-seqについてもDam変異体の利用などで最適化を進め、ナノポアシーケンサーによる検出を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PBATの改良は順調に進行して完成形へと近づきつつあり、領域内支援にも反映できている。また、様々な新しい方法への挑戦も進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
PBATの究極型への道筋も明らかになってきたので、その完成を急ぐ。更にそれを活かした多層エピゲノム解析を目指して、各種エピジェネティックシグナルを人工的メチル化としてゲノムにエンコードした上で内在性のメチル化とともにPBATあるいはナノポアシーケンサーで読み解く方向の技術開発に注力したい。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Base-Resolution Methylome of Retinal Pigment Epithelial Cells Used in the First Trial of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Autologous Transplantation.2019
Author(s)
Araki H, Miura F, Watanabe A, Morinaga C, Kitaoka F, Kitano Y, Sakai N, Shibata Y, Terada M, Goto S, Yamanaka S, Takahashi M, Ito T.
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Journal Title
Stem Cell Reports
Volume: 13
Pages: 761-774
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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