2019 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanism and processe of stenoocclusive vascular diseases caused by RNF213 mutation in inflammatory cellular society
| Project Area | Preventive medicine through inflammation cellular sociology |
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| Project/Area Number |
17H06397
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小泉 昭夫 京都大学, 医学研究科, 名誉教授 (50124574)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
S Youssefian 京都大学, 医学研究科, 教授 (00210576)
手塚 徹 京都大学, スーパーグローバルコース医学生命系ユニット, 特定講師 (50312319)
原田 浩二 京都大学, 医学研究科, 准教授 (80452340)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | RNF213 / ウイルス抗体の保有状況 / E3 ligase / AAA+ / R4810K / Apoptosis |
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| Outline of Annual Research Achievements |
もやもや病は、ウイリス動脈輪近傍動脈を必発として、全身の動脈にも頻繁に閉塞性病変が認められる動脈疾患である。RNF213は、動脈閉塞性疾患に関わる遺伝子であり、R4810K変異は、もやもや病の感受性要因となるが、環境因子および分子レベルでの病理メカニズムは不明である。本研究では、未病から発病に至る環境要因として免疫系要因に着目し疫学研究に着手した。また、E3 ligaseに関わるUbiquitin化シグナル経路での変動に注目し、炎症環境ストレスに曝露により生じる攪乱の解明を目指した。また総括班に設置する炎症細胞社会解析センターと連携し、炎症ストレス下のiPS細胞由来の血管内皮細胞を用い包括的Single cell transcriptome実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
① 免疫系の攪乱因子の疫学研究、②E3 ligaseに関わるUbiquitin化シグナル経路での変動に注目し、炎症環境ストレスに曝露により生じる攪乱の解明、③iPS細胞由来の血管内皮細胞および血管平滑筋細胞の包括的Single cell transcriptome (SCT)の3課題を行った。
①免疫系の攪乱因子の疫学研究：患者血清を用いて、種々のウイルス感染による攪乱、患者の糞便を用いてのヒト腸内細菌叢の解析に着手した。
② 炎症環境ストレスに曝露により生じる攪乱の解明： RNF213のAAA+およびE3ligase活性に注目し、RNF213の機能と変異の影響の検討を行った。まず、RNF213はUbc13をE2としてE3ligase機能を発揮することを見出した。E3ligase の活性中心に存在するもやもや病患者で報告されている9変異のうち、3変異はE3の活性低下を示さず、残りの6変異では、E3の活性の低下を示した。この6つのE3ligaseの機能喪失変異では、NFｋBの活性化し、引き続きCaspase3の分解、Apoptosisを引き起こすことを見出した。一方、E3ligaseの活性低下を起こさない3つの変異では、NFｋBの活性化を起こさず、Apoptosisも誘導させないことが見いだされた。さらに、NFｋBの活性化は、AAA+の喪失により大きく減少することが明らかとなり、AAA+依存性であることが判明した。
③血管内皮細胞および血管平滑筋細胞の包括的SCT：既に我々が確立しているヒト患者由来iPS細胞にCrisper Cas9でR4810K変異をWTに戻す操作を行いEndothelial cell (EC)に分化させた。この操作により遺伝的多様性に由来するシグナルを最小にすることができる。その準備の上にSCTを行い、「炎症性細胞社会」の視点で現在解析しつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
得られた成果を踏まえ、１．血管閉塞に関わるRNF213シグナル系の解明、２． ER stress シグナル系とRNF213、３． Apoptosisに至る細胞分裂の異常、４．免疫系シグナルの修飾因子としての腸内細菌叢の役割、の４課題を行う。
１． 血管閉塞に関わるRNF213シグナル系の解明：RNF213により制御される細胞内シグナル系を広く同定し、既に同定したNFkB/Apoptosis系も含め、その制御機構をリン酸化・ユビキチン化の動態やRNF213結合分子の解析などを起点に検討する。また上記のSCTを遂行し、得られた知見を取りこみ解析する。
２． ER stress シグナル系とRNF213： Akitaマウス由来膵β細胞株においてCRISPR/Cas9法によるRnf213 遺伝子欠失を行い（Rnf213 KO/Akita細胞の作製）、ERストレス関連分子（Cav-1, Cdc42など）の挙動を検討する。
３．Apoptosisに至る細胞分裂の異常の解明： Rnf213変異KI、Rnf213 KO、WTマウスから作成したMEFを用いてlive imagingによりmitosisの比較を行い、染色体、細胞骨格（アクチン、チューブリン）および細胞膜を蛍光により可視化し、動態および細胞運動性・極性の解析を行う。
４． 免疫系シグナルの修飾因子としての腸内細菌叢の役割: RNF213は、T細胞の分化を通じて腸管免疫に影響を与えることを見出したことから、患者・対照血清を用いて、種々のウイルス感染の既往の評価を行う。また、患者（特に他の生活習慣要因の変動が少ない小児）の糞便を採取し、16S rRNA PCRサンプル解析・メタゲノム解析手法を用いてヒト腸内細菌叢の解析を行う。
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Research Products
(8 results)
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[Journal Article] Moyamoya Disease and Spectrums of RNF213 Vasculopathy.2020
Author(s)
Bang OY, Chung JW, Kim DH, Won HH, Yeon JY, Ki CS, Shin HJ, Kim JS, Hong SC, Kim DK, Koizumi A
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Journal Title
Translational Stroke Research
Volume: －
Pages: －
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Presentation] 日本人のアテローム血栓性脳梗塞の強力な遺伝子多型RNF213 p.4810K2019
Author(s)
猪原 匡史, 岡崎 周平, 森本 貴昭, 鎌谷 洋一郎, 上村 鉄平, 原田 浩二, 冨田 努, 東山 綾, 高橋 淳, 中川原 譲二, 古賀 政利, 豊田 一則, 鷲田 和夫, 齊藤 聡, 望月 秀樹, 秦 淳, 二宮 利治, 吾郷 哲朗, 久保 充明, 小泉 昭夫
Organizer
第60回日本神経学会学術大会
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