2019 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Toward an integrative understanding of functional zones in organelles |
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17H06417
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
花田 賢太郎 国立感染症研究所, 細胞化学部, 部長 (30192701)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 薫 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80356782)
下嶋 美恵 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (90401562)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | 小胞体 / ゴルジ体 / 葉緑体 / 脂質輸送 / オルガネラ膜接触部位 / 超解像イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オルガネラ間の脂質輸送は異なるオルガネラ同士の接触する特殊なゾーン（オルガネラ連携ゾーン）において脂質輸送タンパク質群が実行していることが生物種を問わず多様な脂質種で広く明らかになってきた。しかし、その詳細な分子機序や実際に輸送の起こっているゾーンの可視化、この連携ゾーンが生物個体の生存戦略に果たす役割などは未解明である。新学術領域研究「細胞機能を司るオルガネラ・ゾーンの解読」の研究計画班の一つとして当研究班では、小胞体とゴルジ体もしくは葉緑体との間の機能連携およびその制御の分子機序を脂質輸送の観点から研究している。平成31・令和元年度の成果として、（１）CERTを小胞体ーゴルジ体連携ゾーンで適切に機能させることに関わる遺伝子候補群を昨年度までに見出しており、それらについての解析を継続した。一方で、先天性精神発達遅滞の原因変異と示唆されているヒトCERT遺伝子ミスセンス変異の解析にも着手した。（２）植物の小胞体―葉緑体間の脂質輸送に寄与するリン脂質分解酵素ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ (PAH1, PAH2) について、遺伝子冗長性の低く、PAHを1遺伝子しかもたないゼニゴケを用いて解析を進めたところ、植物種や器官ごとにPAHを介した小胞体―葉緑体間脂質輸送経路の寄与度合が異なり、それが栄養欠乏時の生育に大きな影響を与えることが明らかになった。（３）操作が簡単（カメラで写真を撮る程度の手軽さ）な高速超解像顕微鏡が完成した。特殊な位相差顕微鏡に、簡便な画像処理を加えることで、薄い培養細胞で、無染色で小胞体、ミトコンドリア、脂質顆粒を可視化する方法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【動物細胞における小胞体⇔ゴルジ体連携ゾーンに関する研究】CERTは、哺乳動物細胞において、小胞体からゴルジ体へとセラミドを輸送するタンパク質である。本年度は、CERTを小胞体ーゴルジ体連携ゾーンで適切に機能させることに関わる遺伝子を複数見出すことに成功した。また、CERT機能は自身の多重リン酸化によって抑制制御されており、この抑制制御の破綻は精神発達遅滞を引き起こすと示唆されている。この度、重度の精神発達遅滞患者のCERT遺伝子上に報告例のないde novo変異が見出され、その変異がCERT機能に及ぼす影響を細胞レベルで解析し始めた（神奈川県立こども医療センター・遺伝科との共同研究）。市販の位相差対物レンズと画像処理を組み合わせ、薄い細胞で、無染色で小胞体を観察する方法を考案した。蛍光染色が不要なので、数時間は、細胞内小器官の観察できることを示した。
【植物細胞における小胞体⇔葉緑体連携ゾーンに関する研究】植物において、PAHは小胞体から葉緑体への脂質供給に寄与するリン脂質分解酵素であるが、その細胞内局在については不明な点が多かった。本年度、遺伝子冗長性が低いゼニゴケを用いてPAHの解析を進めた。ゲノム編集法によりゼニゴケPAH欠損変異体を作出し、野生株と生育比較したところ、生育条件に関わらず新鮮重量が低下すること、また、特に仮根の膜脂質組成に大きな影響を与えることがわかった。脂質組成および脂肪酸種の詳細な解析により、PAHはシロイヌナズナ同様、ゼニゴケにおいても小胞体―葉緑体間脂質輸送に寄与しているが、PAHを介した小胞体―葉緑体間脂質輸送が葉緑体膜脂質合成に寄与する度合は器官によって異なり、特に仮根においてその寄与が大きいため、仮根伸長に影響を与えることが明らかになった。さらに、シロイヌナズナで、葉緑体運動とアクチン骨格の関係を超解像の動画で捉えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)脂質輸送に関連する小胞体―ゴルジ体/葉緑体連携ゾーン形成機序 ①昨年までに見出した遺伝子群から特にCERTを小胞体ーゴルジ体連携ゾーンで適切に機能させることに重要な働きをしていると予想される遺伝子に絞って解析を継続する。②令和元年度に、ゼニゴケを材料としてPAHを介した小胞体―葉緑体間脂質輸送の寄与の度合いは器官によって異なることがわかった。今後はどのようなメカニズムで器官特異的な脂質輸送を可能にしているのか、その分子メカニズムを解明する。また、シロイヌナズナのPAHについては、抗体作成を完了し、生化学的手法による細胞内局在解析を進める。
(2) 小胞体⇔ゴルジ体/葉緑体連携ゾーンの超解像イメ－ジング解析 ①STEDによるHeLa細胞のCERTの解析は、昨年に続き、ゴルジ、小胞体、CIRTの関係の可視化解析を続ける。また、無染色で小胞体を直接観察できる画像処理方法を考案したので、この方法を超解像と組合せ、小胞体ゴルジ間の輸送の解析を試みる。
(3) 小胞体―ゴルジ体/葉緑体連携ゾーンが生存戦略に果たす役割 ①昨年度に継続して、哺乳動物の小胞体―ゴルジ体連携ゾーンの形成に関わると示唆されているいくつかの遺伝子を欠損させたHeLa細胞変異株を作製し、細胞生育やCERT機能への影響を解析する。リン酸化によるCERT機能の抑制制御は、精神発達遅滞を伴うヒト遺伝病とも関連しており、令和2年度は、精神発達遅滞患者の有するCERT遺伝子上の変異がCERT機能に及ぼす影響を細胞レベルで明らかにする。②PAHと同様にリン欠乏時の小胞体―葉緑体間の脂質輸送に関わると考えられているnon-specific phospholipase C5過剰発現体の作出を完了したため、今後は栄養欠乏ストレスに応答した脂質組成変化や脂質ターンオーバーへの影響を調べることで脂質輸送への寄与を明らかにする。
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| Remarks |
マスコミ報道
ミトコンドリアの動画を提供 NHK スペシャル 「食の起源」 11月24日放送 ”第１集「ご飯」～健康長寿の敵か？味方か？～”
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