2020 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Toward an integrative understanding of functional zones in organelles |
|---|
| Project/Area Number |
17H06417
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
|---|
Principal Investigator |
花田 賢太郎 国立感染症研究所, 品質保証・管理部, 主任研究官 (30192701)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 薫 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80356782)
下嶋 美恵 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (90401562)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
|
| Keywords | 脂質輸送 / 小胞体 / ゴルジ体 / 葉緑体 / オルガネラ膜接触部位 / 超解像イメージング |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
オルガネラ間の脂質輸送は、異なるオルガネラ同士の接触する特殊なゾーン（オルガネラ連携ゾーン）において脂質輸送タンパク質群が実行していることが生物種を問わず多様な脂質種で広く明らかになってきた。しかし、その詳細な分子機序や実際に輸送の起こっているゾーンの可視化、この連携ゾーンが生物個体の生存戦略に果たす役割などは未解明である。新学術領域研究「細胞機能を司るオルガネラ・ゾーンの解読」の研究計画班の一つとして当研究班では、小胞体とゴルジ体もしくは葉緑体との間の機能連携およびその制御の分子機序を脂質輸送の観点から研究している。令和２年度の成果として、（１）スフィンゴミエリン（SM）結合性毒素ライセニンへの耐性が欠損により付与される遺伝子の網羅的探索により同定した、小胞体―ゴルジ体連携ゾーンでCERTを適切に機能させることに関わる遺伝子候補群から、ゴルジ体におけるゾーン形成への関与が期待される遺伝子群（PI4KB、 ACBD3、 C10orf76）とCERTの機能制御に関与するキナーゼ遺伝子（CSNK1G3)に着目した。ノックアウト（KO）細胞や変異細胞を作製し、解析を進めた。（２）植物の小胞体―葉緑体間の脂質輸送に寄与するリン脂質分解酵素ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ (PAH1、 PAH2) については、シロイヌナズナPAH1、PAH2のそれぞれに特異的な配列に対するペプチド抗体を作製、特異性について確認し、ゼニゴケにおける脂質輸送についてはもう１つの候補リン脂質分解酵素NPCの解析を進めた。（３）無染色で小胞体やミトコンドリア等のオルガネラが観察できるアポダイズド位相差顕微鏡を感染研に導入し、無染色観察が可能になった。小胞体、ミトコンドリア、核内構造体のほか、ウイルスの複製オルガネラが無染色で観察できた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【動物細胞における小胞体⇔ゴルジ体連携ゾーンに関する研究】CERTは、哺乳動物細胞において小胞体からゴルジ体へとセラミドを輸送するタンパク質である。これまでに同定したCERTを小胞体―ゴルジ体連携ゾーンで適切に機能させることに関わる遺伝子候補から、ゴルジ体におけるゾーン形成への関与が期待される遺伝子群（PI4KB、 ACBD3、 C10orf76）とCERT機能を抑制させる多重リン酸化を実行するキナーゼ遺伝子(CSNK1G3)を選択し、KO細胞や変異細胞を作製・解析した。KO細胞の解析から、HeLa細胞ではCERTが機能する連携ゾーンは少なくとも2種類存在することが示唆された。キナーゼ遺伝子のKO細胞と変異細胞の比較解析から、キナーゼ自体の機能制御機序の一端を明らかにした。STED観察では、蛍光ラベルした抗体を生きた細胞に取り込ませると、数分～10分程度、STEDでライブセル観察ができることを見出した。蛍光タンパク質よりもダメージがない観察ができることを見出した。小胞体を無染色で観察できる、プログラム制御のアポダイズド位相差顕微鏡を、感染研に導入し、無染色でのミトコンドリア、小胞体、核内構造体などオルガネラ観察を実現した。さらに病原体感染細胞でのオルガネラ観察を進めた。【植物細胞における小胞体⇔葉緑体連携ゾーンに関する研究】これまでに、ゼニゴケを用いてPAHの解析を進め、ゲノム編集法により得たゼニゴケPAH欠損変異体と野生株について生育比較したところ、PAHはシロイヌナズナ同様、ゼニゴケにおいても小胞体―葉緑体間脂質輸送に寄与していることが明らかになった。しかし、リン欠乏生育下のゼニゴケにおいて、PAHを介したリン脂質分解に伴う脂質輸送への寄与の度合は低いことがわかったため、別のリン脂質分解酵素NPCに着目して変異体の作出を進めた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
（１）脂質輸送に関連する小胞体―ゴルジ体/葉緑体連携ゾーン形成機序：CERTが小胞体―ゴルジ体膜接触部位で機能するために必要な因子群候補の解析を進め、来年度中の論文執筆を目指す。一方で、CERT PHドメイン下流の多重リン酸化がCERT機能を阻害する機序においては、当該多重リン酸化部位と分子内相互作用する領域候補を見出したので、この発見を基礎にさらに解析を進める。本年度までに、ゼニゴケを材料としてPAHを介した小胞体―葉緑体間脂質輸送の寄与の度合いは器官によって異なることがわかった。今後はどのようなメカニズムで器官特異的な脂質輸送を可能にしているのか、その分子メカニズムを解明する。また、シロイヌナズナのPAHについては、抗体作製を完了し、生化学的手法による細胞内局在解析を進める。
（２） 小胞体⇔ゴルジ体/葉緑体連携ゾーンの超解像イメ－ジング解析：HeLa細胞内のCERTの局在をSTED解析する。シロイヌナズナでは、生化学的解析結果を反映したイメージング解析を目指す。また、無染色の小胞体を直接観察できる位相差法を考案したので、この方法で、小胞体―ゴルジ間の輸送を解析することを目指す。
（３）小胞体―ゴルジ体/葉緑体連携ゾーンが生存戦略に果たす役割：哺乳動物の小胞体―ゴルジ体連携ゾーンの形成に関わると示唆されているいくつかの遺伝子を欠損させたHeLa細胞変異株を作製し、細胞生育やCERT機能への影響を解析する。PAHと同様にリン欠乏時の小胞体―葉緑体間の脂質輸送に関わると考えられているnon-specific phospholipase C5過剰発現体の作出を完了したため、今後は栄養欠乏ストレスに応答した脂質組成変化や脂質ターンオーバーへの影響を調べることで脂質輸送への寄与を明らかにする。
|
| Remarks |
下嶋グループの成果のマスコミ報道：
「植物のリン酸欠乏ストレス 窒素過剰施肥で緩和 東工大など」、化学工業日報、2021年2月3日朝刊11面
|
Research Products
(23 results)
