2020 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of GPI-anchored protein sorting zone at the ER exit site
| Project Area | Toward an integrative understanding of functional zones in organelles |
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| Project/Area Number |
17H06420
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
中野 明彦 国立研究開発法人理化学研究所, 光量子工学研究センター, 副センター長 (90142140)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒川 量雄 国立研究開発法人理化学研究所, 光量子工学研究センター, 専任研究員 (40333504)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | 超解像ライブイメージング / GPIアンカー選別ゾーン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母をモデルとしたGPIアンカー型蛋白質の輸送ゾーンの解明を目指している。小胞体からゴルジ体への積荷蛋白質輸送はCOPII小胞が担う。COPII小胞は小胞体上のER exit site (ERES)と呼ばれる領域に集積する。新規合成された積荷蛋白質の動態解析のために、COPII小胞形成に温度感受性の損傷をもつ酵母変異株で積荷蛋白質をGalプロモーター制御下に発現させ、ガラクトース添加により積荷蛋白質を合成し、同時に非許容温度でゴルジ体への輸送を阻害した後、許容温度に戻して集積した積荷蛋白質のみが小胞体からゴルジ体への輸送されるパルス・チェイス・ライブイメージングを開発した。
これまでに、GPIアンカー型蛋白質（Cwp2, Gas1）は、一部のERES近傍に集積し、通常の膜貫通部位をもつ非GPIアンカー蛋白質（Axl2, Mid2）は小胞体全域に分布すること、両者の局在は排他的で、異なるERESに選別的に取り込まれることを明らかにし、小胞体における積荷蛋白質の選別輸送ゾーンの存在を明確にした。
出芽酵母では、GPIアンカーのGPIリピッドが極長鎖セラミド（C26）化される。そのセラミド合成酵素を欠損させ、代わりに綿のセラミド合成酵素を発現する出芽酵母株（GhLag1）では、脂肪酸鎖長が短いC18/C16セラミドが合成され小胞体の膜に蓄積する。パルス・チェイス・ライブイメージングによりC18/C16セラミドが小胞体セラミドの主成分となったGhLag1株で解析すると、Gas1はMid2と同様に小胞体全域に広く分布し、Mid2と同じERESに取り込まれたことから、小胞体脂質に含まれるセラミドの脂肪酸長が、GPIアンカー型蛋白質の選別ゾーンへの集積とERESへの選別に決定的な役割を果たすことを明らかにした（Sci. Adv. 誌発表）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
これまでに、出芽酵母の小胞体からゴルジ体への積荷蛋白質輸送について、SCLIMによる高時空間分解能3Dライブイメージングを行ってきた。小胞体で新規に合成されたGPIアンカー型積荷蛋白質（Cwp2, Gas1）と非GPIアンカー型積荷蛋白質（Axl2, Mid2）は、異なる小胞体内ゾーンへと選別され、それぞれ異なるERESへと取り込まれることを明らかにし、小胞体における積荷蛋白質の選別輸送ゾーンの存在を明確にすることができた。
GPIアンカー型蛋白質のGPIアンカーは小胞体内で順次修飾を受ける。出芽酵母のGPIアンカー型蛋白質のGas1は、GPIリピッドが極長鎖セラミド（C26）化される。そこで、本年度は出芽酵母のセラミド合成酵素を欠損させ、代わりに綿のセラミド合成酵素を発現する出芽酵母株（GhLag1）を用いて、小胞体におけるGas1の選別輸送ゾーンのセラミドの脂肪酸鎖長による制御に着目して解析を行った。GhLag1株では、小胞体のセラミドの脂肪酸鎖長がC26ではなくC18, C16が主成分となった。このGhLag1株では、Gas1は通常と同様に、GPIグリカンの修飾を受けた後、p24ファミリー蛋白質複合体と結合して細胞膜まで輸送された。ところが、ERESへの選別を観察すると、GhLag1株ではGas1はMid2と同様に小胞体全域に広く分布し、Mid2と同じERESに取り込まれた。このことから、小胞体セラミドの脂肪酸長がGPIアンカー型蛋白質の選別ゾーンへの集積とERESへの選別に決定的な役割を果たすことを明らかにすることができた。この結果は、蛋白質選別制御における脂質の役割を世界で初めて実験的に示したものであり、発表論文（Sci. Adv. 誌）もきわめて大きな反響を得た。以上のことから、本年度の研究は当初の計画以上に進展したと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究で、小胞体でのGPIアンカー型蛋白質Gas1のERES近傍への局在化と選別的なERESへの取り込みが小胞体脂質のセラミドの脂肪酸長により制御されていることが明らかとなり、小胞体でのGPIアンカー型積荷蛋白質の選別における脂質の重要性が示された。また、これまでに計画した種々のGPIアンカー修飾酵素変異株を用いた解析でも、これらの変異株ではGPIアンカー型蛋白質の選別ゾーンへの集積が阻害されており、GPIアンカー修飾と小胞体脂質との相互作用がGPIアンカー型蛋白質の選別輸送において重要であるデータが蓄積されてきている。
今後は、GPIアンカー型蛋白質Cwp2, Gas1のGPIグリカンの修飾に着目し、GPIグリカンの修飾酵素変異体を用いて小胞体内でのGPIアンカー蛋白質選別ゾーン形成とERESへの選別取り込みの分子機構を探る。加えて、GPIアンカー型蛋白質と非GPIアンカー型蛋白質が異なるERESに集積した後、ゴルジ体のcis槽が選択的に接近、接触して積荷を受け取るのかなど、SCLIMを用いたライブイメージングによって詳細に比較、解析することで、空間的な選別機構、時間的な選別機構に迫り、小胞体ERESにおける選別ゾーン形成の意義を明らかにする。引き続き本研究は、スペインセビリア大学のManuel Muniz教授の協力を得て進めていく。
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